Mesure de Différentiellement méthylé<em> INS</em> ADN Espèce dans des échantillons de sérum humain en tant que mort cellulaire Biomarker de l'Islet β
Summary
Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.
Abstract
The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.
Introduction
Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto – immune qui se caractérise par la destruction des îlots de Langerhans productrices d'insuline par les cellules β des cellules T autoréactives 1. Le diagnostic de DT1 est généralement faite sur mesure (glycémie> 200 mg / dl) de l'hyperglycémie chez un jeune individu maigre, qui pourrait présenter une acidocétose comme preuve d'une carence en insuline. Au moment du diagnostic de diabète de type 1, il existe des preuves pour une perte substantielle de la fonction des cellules β et la masse (50-90%) 2. Dans les études cliniques, plusieurs médicaments modulateurs immunitaires qui ont été instituées au moment du diagnostic ont donné lieu à la stabilisation de la fonction des cellules β (et probablement de masse), mais aucune n'a abouti à une rémission clinique de la maladie, une constatation qui a soulevé l'appel pour le développement de biomarqueurs pour la détection précoce de la maladie et pour le suivi longitudinal de l' efficacité de la combinaison des thérapies 3,4. Les efforts déployés par des consortiums internationaux, une telleest le Consortium Réseau de recherche sur l' îlot humain au National Institutes of Heath 5, ont souligné la nécessité de développer des biomarqueurs qui mettent l' accent sur le stress cellulaire β et la mort dans le DT1.
Conformément à ces efforts, notre groupe et d' autres ont récemment mis au point des tests de biomarqueurs qui mesurent en circulation, des fragments d'ADN épigénétique modifiés qui découlent principalement de la mort des cellules ß 6-9. Dans tous les essais publiés à ce jour, l'accent a été mis sur la quantification du gène humain codant pour la préproinsuline (INS), ce qui démontre un plus grand degré de sites CpG non méthylés dans les régions codantes et du promoteur par rapport à d' autres types de cellules. La libération de fragments d' ADN non méthylé INS a émis l' hypothèse que découlant principalement de la mort (nécrotiques, apoptotiques) cellules ß. Nos études récentes ont montré que chez les jeunes, les élévations de l'ADN non méthylé INS à la fois et méthylé en position -69 pb ( par rapport à til transcriptionnelle site de départ) ont été observés dans la nouvelle apparition du DT1, et ensemble a servi en tant que biomarqueurs spécifiques pour cette population 6. Ces dosages de marqueurs biologiques impliquent l'isolement de l'ADN acellulaire de sérum ou de plasma en utilisant des kits commerciaux de rotation, suivie d'une conversion au bisulfite de l'ADN isolé (pour convertir les cytosines non méthylées à uraciles, en laissant intact cytosines méthylées).
Dans ce rapport, nous décrivons les aspects techniques de la collecte des échantillons de sérum, l' isolement de l' ADN sans cellules à partir de sérum, conversion au bisulfite, et les performances des gouttelettes PCR numérique (désormais, PCR numérique) pour l' ADN méthylé INS différentiellement.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthylation de cytosines par ADN méthyltransférases permet le contrôle épigénétique de la transcription de nombreux gènes. Le gène de l' INS chez l'être humain est presque exclusivement exprimée dans des cellules d' îlots β, et il semble y avoir une corrélation entre la fréquence de méthylation de cytosine dans le gène INS silençage de sa transcription 11. En tant que tel, la plupart des types de cellules présentent sensiblement plus hautes fréquences de m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (to RGM). We wish to acknowledge the assistance of the Indiana Diabetes Research Center Translation Core supported by National Institutes of Health grant P30 DK097512.
Materials
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl and MgCl) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 mL PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
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