Summary

Misura della differenzialmente metilato<em> INS</em> DNA Specie in campioni di siero umano come una cellula morte biomarker di Islet β

Published: December 21, 2016
doi:

Summary

Islet β cell death precedes development of type 1 diabetes, and detecting this process may allow for early therapeutic intervention. Here, we provide a detailed description of how to measure differentially methylated INS DNA species in human serum as a biomarker of β cell death.

Abstract

The death of islet β cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank hyperglycemia, especially in type 1 diabetes. The development of sensitive and reliable biomarkers of β cell death may allow for early therapeutic intervention to prevent or delay the development of diabetes. Recently, several groups including our own have reported that cell-free, differentially methylated DNA encoding preproinsulin (INS) in the circulation is correlated to β cell death in pre-type 1 diabetes and new-onset type 1 diabetes. Here, we present a step-by-step protocol using digital PCR for the measurement of cell-free INS DNA that is differentially methylated at cytosine at position -69 bp (relative to the transcriptional start site). We demonstrate that the assay can distinguish between methylated and unmethylated cytosine at position -69 bp, is linear across several orders of magnitude, provides absolute quantitation of DNA copy numbers, and can be applied to samples of human serum from individuals with new-onset type 1 diabetes and disease-free controls. The protocol described here can be adapted to any DNA species for which detection of differentially methylated cytosines is desired, whether from circulation or from isolated cells and tissues, and can provide absolute quantitation of DNA fragments.

Introduction

Il diabete di tipo 1 (diabete di tipo 1) è una malattia autoimmune che si caratterizza per la distruzione di isolotto che producono insulina β cellule da parte delle cellule T autoreattive 1. La diagnosi di diabete di tipo 1 è in genere effettuato al momento della misurazione della (glicemia> 200 mg / dl) iperglicemia in una magra, giovane individuo, che potrebbe presentarsi con chetoacidosi come prova di deficit di insulina. Al momento della diagnosi di diabete di tipo 1, vi è evidenza di sostanziale perdita della funzione delle cellule β e la massa (dal 50 – 90%) 2. Negli studi clinici, diversi farmaci modulatori immunitario che sono stati istituiti al momento della diagnosi ha portato alla stabilizzazione della funzione delle cellule β (e presumibilmente di massa), ma nessuno ha portato a remissione clinica della malattia, una scoperta che ha sollevato la chiamata per lo sviluppo di biomarcatori per la diagnosi precoce della malattia e per il tracciamento longitudinale efficacia di terapie combinate 3,4. Gli sforzi da consorzi internazionali, come ad uns Consorzio Research Network Islet Umana presso il National Institutes of Heath 5, hanno sottolineato la necessità di sviluppare biomarcatori che si concentrano sullo stress delle cellule β e la morte nel diabete di tipo 1.

In linea con questi sforzi, il nostro gruppo ed altri hanno recentemente sviluppato test biomarker che misurano circolanti, frammenti di DNA epigeneticamente modificati che nascono principalmente da morire le cellule beta 6-9. In tutti i saggi pubblicati fino ad oggi, il focus è stato sul quantificazione del gene umano codifica preproinsulina (INS), che dimostra maggiori gradi di non metilato siti CpG nelle regioni codificanti e promotore rispetto ad altri tipi di cellule. La liberazione di non metilato frammenti di DNA INS stato ipotizzato come derivanti principalmente dalla morte (necrosi, apoptosi) delle cellule beta. I nostri studi recenti hanno dimostrato che in gioventù, l'innalzamento di DNA sia metilato e metilato INS in posizione -69 bp (rispetto a tegli trascrizionale inizio sito) sono stati osservati in nuova insorgenza diabete di tipo 1, e insieme servito biomarcatori come specifici per questa popolazione 6. Questi dosaggi biomarker comportano l'isolamento di DNA cell-free dal siero o plasma utilizzando kit di spin commerciali, seguita da una conversione bisolfito del DNA isolato (per convertire cytosines non metilato per uracils, lasciando cytosines metilati intatto).

In questo rapporto, descriviamo gli aspetti tecnici della raccolta dei campioni di siero, l'isolamento del DNA cell-free dal siero, la conversione bisolfito, e le prestazioni di goccioline PCR digitale (d'ora in poi, PCR digitale) per differenziale metilato INS DNA.

Protocol

Ethics Statement: Protocols were approved by the Indiana University Institutional Review Board. Parents of subjects provided written informed consent, and children older than 7 years provided assent for their participation. 1. Serum Processing NOTE: The assay as described has been rigorously tested using human serum isolated as follows. Collect blood in one red top (no-additive; uncoated) blood collection tube. Let sit at room temperature for 30 min to allow the clot to form. <li…

Representative Results

Per interpretare i dati in modo appropriato, usiamo i controlli plasmide sia per il target INS DNA non metilato e metilato in ogni seduta PCR digitale. Questi controlli assicurano che i segnali corrispondenti al DNA metilato e non metilato sono chiaramente distinguibili. La Figura 1 mostra i diagrammi di dispersione 2-D corrispondenti a gocce per controlli plasmide contenente bisolfito-convertito non metilato INS DNA (Figura 1A), metila…

Discussion

La metilazione del cytosines di DNA metiltransferasi permette il controllo epigenetico della trascrizione in molti geni. Il gene INS nell'uomo è espresso quasi esclusivamente in isolotto β cellule, e sembra che vi sia una correlazione tra la frequenza di metilazione del cytosines nel gene INS per silenziamento della sua trascrizione 11. Come tale, la maggior parte dei tipi di cellule mostrano sostanzialmente frequenze più elevate di metilazione del gene INS a vari cytosines r…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (to RGM). We wish to acknowledge the assistance of the Indiana Diabetes Research Center Translation Core supported by National Institutes of Health grant P30 DK097512.

Materials

Red Top Vacutainer  Beckon Dickinson 366441 no additive, uncoated interior, 10 ml
Cryovial Tube Simport T310-3A polypropylene, screw cap tube, any size
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51106
Poly(A) Sigma P9403 disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl 
Absolute Ethanol (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-500
DPBS (with CaCl and MgCl) Sigma D8662
0.2 mL PCR 8-strip Tubes MidSci AVST
8-strip Caps, Dome MidSci AVSTC-N
EZ DNA Methylation-Lightning Kit Zymo D5031
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Biorad 1863024
Buffer Control for Probes Biorad 1863052
Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix Life Technologies AH21BH1
EcoR1 New England Biolabs R0101L
twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted Eppendorf 951020346
Pierceable Foil Heat Seal Biorad 1814040
PX1 PCR Plate Sealer Biorad 1814000
QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System Biorad 1864101
Automated Droplet Generation Oil for Probes Biorad 186-4110
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator Biorad 186-4108
Pipet Tips for Automated Droplet Generator Biorad 186-4120
Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator Biorad 186-4125
C1000 Touch Thermal Cycler Biorad 1851197
QX200 Droplet Reader Biorad 186-4003
ddPCR Droplet Reader Oil Biorad 186-3004

References

  1. Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
  2. Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, 32-39 (2005).
  3. Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
  4. Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
  5. . Human Islet Research Network | HIRN Available from: https://hirnetwork.org/ (2016)
  6. Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
  7. Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
  8. Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
  9. Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
  10. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
  11. Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
  12. Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
  13. Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
  14. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
  15. Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
  16. Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
  17. Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  18. Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).

Play Video

Cite This Article
Tersey, S. A., Nelson, J. B., Fisher, M. M., Mirmira, R. G. Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet β Cell Death. J. Vis. Exp. (118), e54838, doi:10.3791/54838 (2016).

View Video