Bir UV-Vis ve Raman Spektroskopisi İmmunoassay Platformu imalatı
Summary
Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.
Abstract
Immünolojik ilişkili antikorların varlığını temel proteinleri tespit etmek için kullanılır. Çünkü araştırma ve klinik ortamlarda onların geniş kullanım, immunoassay aletleri ve malzemelerin büyük altyapı bulunabilir. Örneğin, 96- ve 384-kuyucuklu polistiren plâkalara ticari olarak temin edilebilir ve çeşitli üreticilerden morötesi görünür (UV-Vis) spektroskopisi makineleri için uygun standart bir tasarıma sahiptir. Buna ek olarak, bu tür enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) ve özel bağışıklık tasarımları için immünoglobulinler, tespit etiketleri ve bloke edici maddeler, geniş bir çeşitlilik mevcuttur.
mevcut altyapı rağmen, standart ELISA kitleri pahalı ve zaman alıcı olabilir bireyselleştirilmiş immunoassay geliştirme gerektiren, tüm araştırma ihtiyaçlarını karşılamak değildir. genellikle floresan veya col bağlı olarak, örneğin, ELISA kitleri (bir defada birden fazla analitin tespiti) yetenekleri düşük çoklama vartespiti için orimetric yöntemler. Kolorimetrik ve floresan tabanlı analizler, geniş spektral zirveleri nedeniyle çoklama yetenekleri sınırlıdır. Buna karşılık, Raman Spektroskopisi tabanlı yöntemler nedeniyle dar emisyon zirveleri için çoklama için çok daha büyük bir yeteneği var. Raman spektroskopisi bir başka avantajı Raman habercilerin floresan etiketleri 1'den daha az photobleaching tecrübe olmasıdır. Raman habercilerin floresan ve kolorimetrik etiketleri üzerinde sahip olduğu avantajlara rağmen, protokoller Raman tabanlı immünoassaylar sınırlıdır imal. Bu çalışmanın amacı, UV-Vis analizi ve Raman spektroskopisi ile analitlerin doğrudan saptanması için polistiren plakaları ile birlikte kullanmak için fonksiyonalize probları hazırlanması için bir protokol sağlamaktır. Bu protokol, önceden belirlenmiş altyapı üzerinde sermaye ise araştırmacılar gelecekteki çoklu analit tespiti için bir do-it-yourself yaklaşım sağlayacaktır.
Introduction
Tipik sandviç immüno dolaylı iki antikor kullanarak bir antijen mevcudiyetini algılar. zaptedilen antikoru bir katı yüzeye bağlanmış ve uygun bir antijene yakın bir antikor-antijen kompleksi olduğunda oluşturur. Bir saptama antikor kişiye ve antijene bağlanır. Şekil 1A gösterildiği gibi yıkandıktan sonra, antikor / antijen / antikor kompleksinin kalıntıları ve etiketlenmiş algılama antikoru ile tespit edilir. Tipik algılama geniş bir spektrum zirveleri 2,3 nedeniyle 10 analitlerle çoklama sınırlayan, bir flüoresan veya renk ölçümsel detektörü ile yapılır. Buna karşılık, Raman-tabanlı sistemler kadar 100 analitlerin 2,3 eşzamanlı algılama iddia kaynaklarla gelişmiş çoğullama yetenekleri ile sonuçlanan daha dar emisyon zirveleri var.
Birçok literatür kaynakları IMMUNOASSAYS ilgili önemli yönlerini kapsayacak hangi mevcuttur 4-6 gibi adım-adım olarakAyrıntılar kişiselleştirilmiş ELISA kitleri oluşturun. Ne yazık ki, bu protokoller özelleştirilmiş immun çoklayıcı kapasitesini sınırlayan, flüoresan veya kolorimetrik tespiti içindir. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz Şekil 1B gösterildiği gibi doğrudan bir immunoassay için daha önce 7 yayınlanmış UV-Vis / Raman immunoassayin imal etmek detaylı bir prosedür mevcut.
Bu protokol, işlevselleştirilmiş altın nanopartikül bazlı prob imalat, Şekil 2'de gösterilen içerir. Altın nano partiküller yüzeyi (AuNPs) için Raman habercilerin bağlanarak başlar Raman / UV-Vis probları yapmak için prosedür. AuNPs daha sonra polietilen glikol (PEG) ile ilişkilendirilmiş antikorlar ile fonksiyonalize edilir. AuNPs üzerinde kalan bağlanma yerleri analizi sırasında daha sonra spesifik olmayan bağlanma bilmek AuNPs metoksi polietilen glikol tiyol (mPEG-SH) bağlanmak suretiyle engellenir. hazırlanan AuNP Probes antijenlere bağlanması ile test edilmiştirŞekil 1B 'de gösterildiği gibi bir polistiren plaka oyuklarına sabit. ilişkili Raman habercilerin Raman spektroskopisi ile tespit edilirken plakayı yıkayarak üzerine, AuNP sondaları UV-Vis spektroskopisi kullanılarak tespit edilir. UV-Vis ve Raman spektral verileri birleştiren Bu immünodenemenin yeteneklerini arttırmak, analiz iki yöntem sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ayrıntılı protokolde, adres birçok kritik noktalar vardır. Tek sorun Raman muhabir ve altın nanopartikülünün seçimdir. Protokol bağımsız kullanım için adapte edilmesi yazılmış de, Raman raportör DTTC örnek olarak kullanılmıştır. DTTC pozitif yüklü bir muhabir ve olumsuz gibi sitrat şapkalı AuNPs olarak yüzeyleri ücret bağlanır. Bu protokol, yüzey yükü ile altın nano parçacıklar kullanarak negatif yüklü muhabir için adapte edilebilir. Örneğin, polietilenimin (PEI) başlıklı Au…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.
Materials
| 60nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| In-house built 785nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 |
References
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
- . . The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , (2013).
- Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , (2004).
- . . ELISA development guide. , (2016).
- Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
- Menges, F. . Spekwin32 – optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , (2016).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
- . . EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, (2012).
- Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
- Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
- Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
- Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
- McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).
