בודה UV-Vis ראמאן ספקטרוסקופיה פלטפורמת Immunoassay
Summary
Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.
Abstract
Immunoassays המשמשים לאיתור חלבונים המבוססת על נוכחות של נוגדנים הקשורים. בשל השימוש הנרחב שלהם במחקר במסגרות קליניות, תשתית גדולה של מכשירי immunoassay וחומרים ניתן למצוא. לדוגמא, 96 ו 384 גם צלחות קלקר זמינות מסחרית ויש תכנון סטנדרטי כדי להכיל מכונות ספקטרוסקופיה אולטרה סגולות-גלוי (UV-Vis) מיצרנים שונים. בנוסף, מגוון רחב של נוגדנים, תגי זיהוי, וסוכני חסימת עיצובי immunoassay אישית כגון מבחני immunosorbent enzyme-linked (ELISA) זמין.
למרות התשתית הקיימת, ערכות ELISA סטנדרטיים אינם לענות על כל הצרכים המחקר, המחייב פיתוח immunoassay אישית, אשר יכול להיות יקר זמן רב. לדוגמא, ערכות ELISA יש ריבוב נמוך (זיהוי של יותר אנליטי אחד בכל פעם) יכול כפי שהם תלויים בדרך כלל קרינה או colשיטות orimetric לגילוי. מדד-צבע וניתוחים פלורסנט מבוססת יש יכולות מוגבלות ריבוב בשל פסגות רפאים רחבות. לעומת זאת, ראמאן בשיטות מבוסס ספקטרוסקופיה יש יכולת הרבה יותר עבור ריבוב בשל פסגות פליטה צרות. יתרון נוסף של ספקטרוסקופיית ראמאן הוא שכתבי ראמאן לחוות photobleaching פחות משמעותי מאשר תגי פלורסנט 1. למרות היתרונות שכתבי ראמאן יש מעל תגי פלורסנט colorimetric, פרוטוקולים לפברק immunoassays המבוסס ראמאן מוגבל. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול להכין בדיקות פונקציונליות לשימוש בשילוב עם לוחות קלקר לגילוי ישיר של analytes ידי ניתוח UV-Vis ו ספקטרוסקופיית ראמאן. פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לקחת עשה זאת בעצמך גישה לגילוי רב-אנליטי בעתיד תוך ניצול תשתית שנקבעה מראש.
Introduction
immunoassays כריך האופייני בעקיפין לזהות הנוכחות של אנטיגן באמצעות שני נוגדנים. הנוגדן ללכוד מאוגד משטח יציב ויוצר קומפלקס נוגדן-אנטיגן כשהוא קרוב אנטיגן המתאים. נוגדן זיהוי מכן הוא הציג נקשר אנטיגן. לאחר הכביסה, הנוגדן / אנטיגן / שרידי ההרכב נוגדן והוא זוהה על ידי נוגדן זיהוי שכותרתו כפי שמודגם באיור 1 א. זיהוי טיפוסי נעשה על ידי גלאי פלורסנט או colorimetric, הגבלת ריבוב עד 10 analytes בשל פסגות רפאים רחבות 2,3. לעומת זאת, מערכות מבוססות ראמאן יש הרבה פסגות פליטת צרה וכתוצאה מכך יכול ריבוב משופר עם מקורות בטענת זיהוי סימולטני של עד 100 analytes 2,3.
מקורות ספרות רבים זמינים אשר מכסים היבטים חשובים הקשורים Immunoassays 4 – 6 כגון צעד-אחר-צעדפרטים ליצירת ערכות ELISA אישית. למרבה הצער, פרוטוקולים אלה הם לגילוי פלורסנט או colorimetric, הגבלת יכולת ריבוב של immunoassays אישית. כדי לתת מענה לצורך זה, אנו מציגים נוהל מפורט לפברק את immunoassay UV-Vis / ראמאן שפורסמו בעבר 7 עבור immunoassay ישירה כפי שמודגם באיור 1B.
פרוטוקול זה כולל ייצור של בדיקות מבוססות ננו-חלקיק זהב פונקציונלי, באיור 2. ההליך לעשות בדיקות ראמאן / UV-Vis מתחיל באמצעות קשירה לכתבי ראמאן אל פני השטח של ננו-חלקיקי זהב (AuNPs). AuNPs הם פונקציונלי אז עם נוגדנים הקשורים פוליאתילן גליקול (PEG). אתרי קישור היא נשאר על AuNPs חסומים באמצעות קשירת תיאול פוליאתילן גליקול methoxy (MPEG-SH) כדי AuNPs למנוע עוקב חייב הלא ספציפי במהלך ניתוח. בדיקות AuNP המוכנות נבדקות באמצעות קשירה אנטיגניםמקובע בארות צלחת קלקר כפי שמודגם באיור 1B. לאחר שטיפת הצלחת, חלליות AuNP מזוהות באמצעות ספקטרוסקופיית UV-Vis בעוד כתבי ראמאן הקשורים מזוהים עם ספקטרוסקופיית ראמאן. שילוב נתונים ספקטרליים UV-Vis ראמאן מספק שתי שיטות של ניתוחים, שיפור היכולות של immunoassay זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול המפורט, ישנם מספר נקודות קריטיות לכתובת. נושא אחד הוא הבחירה של כתב רמן ננו-חלקיקים מזהב. אף על פי הפרוטוקול נכתב כדי להיות מותאם לשימוש אישי, כתב ראמאן DTTC שמש כדוגמא. DTTC הוא כתב מטען חשמלי חיובי ונקשר טיעונים שליליים משטחים כגון AuNPs כתרי ציטראט. פרוטוקול זה י…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.
Materials
| 60nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| In-house built 785nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 |
References
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
- . . The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , (2013).
- Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , (2004).
- . . ELISA development guide. , (2016).
- Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
- Menges, F. . Spekwin32 – optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , (2016).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
- . . EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, (2012).
- Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
- Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
- Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
- Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
- McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).
