Het vervaardigen van een UV-Vis en Raman spectroscopie Immunoassay Platform
Summary
Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.
Abstract
Immunoassays worden gebruikt om eiwitten op basis van de aanwezigheid van bijbehorende antilichamen. Door hun grote gebruik in onderzoek en klinische settings, kan een grote infrastructuur van immunoassay instrumenten en materialen te vinden. Bijvoorbeeld, 96- en 384-well polystyreen platen zijn in de handel verkrijgbaar en hebben een standaard ontwerp aan ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) spectroscopie machines van verschillende fabrikanten tegemoet te komen. Daarnaast is een grote verscheidenheid aan immunoglobulinen, detectie labels en blokkeringsmiddelen voor aangepaste ontwerpen immunoassay zoals enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) zijn beschikbaar.
Ondanks de bestaande infrastructuur, hoeft standaard ELISA-kits niet voldoen aan alle behoeften aan onderzoek, waarvoor geïndividualiseerde immuno-ontwikkeling, die duur en tijdrovend kan zijn. Bijvoorbeeld, ELISA kits lage multiplexing (detectie van meer dan één analyt tegelijkertijd) kunnen leveren als gewoonlijk afhankelijk fluorescentie of colorimetric methoden voor detectie. Colorimetrische en fluorescerende gebaseerde analyses hebben beperkte multiplexing mogelijkheden als gevolg van brede spectrale pieken. Daarentegen Raman-spectroscopie gebaseerde werkwijzen hebben een veel grotere capaciteit voor multiplexen door smalle piekt. Een ander voordeel van Raman spectroscopie is dat Raman verslaggevers ervaren aanzienlijk minder fotobleken dan TL-tags 1. Ondanks de voordelen die Raman verslaggevers hebben meer dan fluorescerende en colorimetrische labels, protocollen te fabriceren Raman-gebaseerde immunoassays zijn beperkt. Het doel van dit document is een protocol gefunctionaliseerde probes te bereiden voor gebruik in combinatie met polystyreen platen voor directe detectie van analyten door UV-Vis analyse en Raman spectroscopie bieden. Dit protocol zal toelaten onderzoekers om een doe-het-zelf-aanpak voor de toekomstige multi-analytdetectiezone terwijl het benutten van vooraf vastgestelde infrastructuur.
Introduction
Typische sandwich immunoassays indirect detecteren van de aanwezigheid van een antigeen met twee antilichamen. De capture-antilichaam wordt gebonden aan een vast oppervlak en vormt een antilichaam-antigeen complex als in de nabijheid van een geschikt antigeen. Een detectie antilichaam wordt vervolgens ingebracht en bindt aan het antigen. Na wassen wordt het antilichaam / antigeen / antilichaamcomplex overblijfselen en gedetecteerd door het gelabelde detectie antilichaam zoals getoond in Figuur 1A. Typische detectie wordt uitgevoerd door een fluorescente of colorimetrische detector, multiplexing beperkt tot 10 analyten door brede spectrale pieken 2,3. Daarentegen Raman-gebaseerde systemen veel smallere emissiepieken waardoor er betere mogelijkheden met multiplexing bronnen beweren gelijktijdige detectie tot 100 analyten 2,3.
Vele literatuurbronnen beschikbaar die belangrijke aspecten omvatten immunoassays 4-6 als de stap-voor-stapDetails om gepersonaliseerde ELISA-kits te creëren. Helaas, deze protocollen zijn voor fluorescerende of colorimetrische detectie, het beperken van multiplexing vermogen van op maat gemaakte immunoassays. Om hieraan te voldoen, presenteren wij een gedetailleerde procedure voor de UV-Vis / Raman immunoassay eerder gepubliceerd 7 een directe immunoassay zoals in figuur 1B fabriceren.
Dit protocol omvat de fabricage van gefunctionaliseerde goud-nanodeeltjes probes, geïllustreerd in figuur 2. De procedure voor de Raman / UV-Vis probes maken begint door binding Raman reporters aan het oppervlak van goud nanodeeltjes (AuNPs). De AuNPs worden vervolgens gefunctionaliseerd met antilichamen die zijn gekoppeld aan polyethyleenglycol (PEG). Resterende bindingsplaatsen op de AuNPs worden geblokkeerd door binding methoxypolyethyleenglycol thiol (mPEG-SH) naar AuNPs daaropvolgende niet-specifieke binding tijdens de analyse te voorkomen. De bereide AuNP probes getest door binding aan antigenenbevestigd aan de putjes van een polystyreen plaat zoals getoond in figuur 1B. Na wassen van de plaat, worden de AuNP probes gedetecteerd met UV-Vis-spectroscopie en de daarmee samenhangende Raman reporters worden gedetecteerd met Raman spectroscopie. De combinatie van UV-Vis en Raman spectrale gegevens op twee manieren van analyses, het verbeteren van de mogelijkheden van deze immunoassay.
Protocol
Representative Results
Discussion
In de gedetailleerde protocol, zijn er verschillende kritische punten aan te pakken. Een probleem is de keuze van Raman reporter en gouden nanodeeltjes. Hoewel het protocol worden aangepast voor individueel gebruik werd geschreven, werd het Raman reporter DTTC als voorbeeld. DTTC is een positief geladen reporter en bindt aan negatief geladen oppervlakken zoals citraat bedekte AuNPs. Dit protocol kan worden aangepast voor negatief geladen reporters met gouden nanodeeltjes met een positieve oppervlaktelading. Bijvoorbeeld…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.
Materials
| 60nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| In-house built 785nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 |
References
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
- . . The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , (2013).
- Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , (2004).
- . . ELISA development guide. , (2016).
- Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
- Menges, F. . Spekwin32 – optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , (2016).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
- . . EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, (2012).
- Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
- Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
- Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
- Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
- McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).
