Summary

La fabricación de un UV-Vis y espectroscopia Raman Plataforma de Inmunoensayo

Published: November 10, 2016
doi:

Summary

Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.

Abstract

Los inmunoensayos se usan para detectar proteínas en base a la presencia de anticuerpos asociados. Debido a su amplio uso en la investigación y la práctica clínica, una gran infraestructura de los instrumentos y materiales de inmunoensayo se puede encontrar. Por ejemplo, 96 y 384 pocillos placas de poliestireno están disponibles comercialmente y tienen un diseño estándar para acomodar máquinas espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) de diferentes fabricantes. Además, una amplia variedad de inmunoglobulinas, etiquetas de detección, y agentes de bloqueo para diseños personalizados de inmunoensayos tales como ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA) están disponibles.

A pesar de la infraestructura existente, kits de ELISA estándar no cumplen todas las necesidades de investigación, lo que requiere el desarrollo de inmunoensayo individualizado, que puede ser costoso y consume mucho tiempo. Por ejemplo, kits de ELISA tienen baja multiplexación (detección de más de un analito a la vez) capacidades, ya que por lo general dependen de la fluorescencia o la colmétodos orimetric para la detección. Colorimétricos y análisis basados ​​fluorescentes tienen una capacidad limitada de multiplexación debido a picos anchos espectrales. Por el contrario, los métodos basados ​​en la espectroscopia Raman tienen una capacidad mucho mayor para la multiplexación debido a picos de emisión estrechos. Otra de las ventajas de la espectroscopia Raman es que los reporteros Raman experimentan significativamente menos photobleaching que las etiquetas fluorescentes 1. A pesar de las ventajas que tienen sobre la prensa Raman etiquetas fluorescentes y colorimétricos, protocolos para fabricar los inmunoensayos basados ​​en Raman son limitadas. El propósito de este trabajo es proporcionar un protocolo para preparar sondas funcionalizadas para utilizar en conjunción con placas de poliestireno para la detección directa de analitos por análisis UV-Vis y espectroscopía Raman. Este protocolo permitirá a los investigadores a adoptar un enfoque do-it-yourself para la futura detección de múltiples análisis al mismo tiempo aprovechar la infraestructura ya establecida.

Introduction

inmunoensayos de tipo sándwich típicos detectar indirectamente la presencia de un antígeno usando dos anticuerpos. El anticuerpo de captura se une a una superficie sólida y forma un complejo anticuerpo-antígeno cuando en la proximidad de un antígeno apropiado. Un anticuerpo de detección se presentó a continuación y se une al antígeno. Después del lavado, el anticuerpo / antígeno / restos complejo de anticuerpo y se detecta por el anticuerpo de detección marcado tal como se demuestra en la Figura 1A. Detección típica se realiza por un detector fluorescente o colorimétrico, lo que limita la multiplexación a 10 analitos debido a picos anchos espectrales 2,3. Por el contrario, los sistemas basados en Raman tienen picos de emisión mucho más estrechas que resultan en las capacidades de multiplexación mejoradas con fuentes que afirman la detección simultánea de hasta 100 analitos 2,3.

Muchas fuentes bibliográficas están disponibles que cubren aspectos importantes relacionados con inmunoensayos 4 6, como paso a pasodetalles para crear kits ELISA personalizadas. Desafortunadamente, estos protocolos son para la detección fluorescente o colorimétrico, lo que limita la capacidad de multiplexación de inmunoensayos personalizados. Para hacer frente a esta necesidad, se presenta un procedimiento detallado para fabricar el / Raman inmunoensayo UV-Vis previamente publicado 7 para un inmunoensayo directo como se ilustra en la Figura 1B.

Este protocolo incluye la fabricación de sondas basados en nanopartículas de oro funcionalizada, que se ilustra en la Figura 2. El procedimiento para hacer las sondas / UV-Vis Raman comienza por reporteros Raman unión a la superficie de nanopartículas de oro (AuNPs). Los AuNPs son entonces funcionalizados con anticuerpos que se asocian con polietilenglicol (PEG). sitios de unión restantes en la AuNPs se bloquean por la unión de tiol metoxi polietilenglicol (mPEG-SH) para AuNPs para evitar la posterior unión no específica durante el análisis. Las sondas AUNP preparados se prueban mediante la unión a antígenosfijado a los pocillos de una placa de poliestireno, como se ilustra en la Figura 1B. Tras lavar la placa, las sondas AUNP se detectan utilizando espectroscopia UV-Vis, mientras que los reporteros Raman asociados se detectan con la espectroscopia Raman. La combinación de datos UV-Vis y espectral Raman proporciona dos métodos de análisis, la mejora de las capacidades de este inmunoensayo.

Protocol

1. Preparación de tampones Phosphate Buffered Saline (PBS) Diluir 50 ml de 10x PBS con 450 ml de agua de grado HPLC para hacer una concentración de 1 x PBS. Filtro estéril la solución con un filtro de 0,22 micras. Conserve la solución a temperatura ambiente. Preparación de solución salina tamponada con Tris + Tween 20 (TBST) Diluir 50 ml de solución salina tamponada con Tris 10x (TBS) con 450 ml de agua de grado HPLC par…

Representative Results

En este estudio, se utilizaron 60 partículas de oro nm para espectroscopía UV-Vis. UV-Vis espectros de absorción de 400 a 700 nm fueron recogidos y las áreas de los picos correspondientes a cada concentración AuNP se determinaron usando un software de análisis espectral de código abierto 8. Antes de pico de integración, los espectros recogidos se sometió a corrección de línea base usando un ajuste polinómico de tres puntos. Áreas de los picos se utilizaron para generar una curva de calibración l…

Discussion

En el protocolo detallado, hay varios puntos críticos para abordar. Una cuestión es la elección del reportero Raman y nanopartículas de oro. Aunque el protocolo fue escrito para ser adaptado para su uso individual, el Raman reportero DCTC fue utilizado como un ejemplo. DCTC es un reportero de carga positiva y se une a superficies tales como citrato AuNPs capsulado cargado negativamente. Este protocolo puede ser adaptado para la prensa de carga negativa mediante el uso de nanopartículas de oro con una carga superfic…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.

Materials

60nm Gold Nanoparticle Ted Pella, Inc. 15708-6 These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter.
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Methanol Pharmco-Aaper 339000000
Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 Scy Tek TBD999
Bottle Top Filtration Unit VWR 97066-202
Tween 20 (polysorbate 20) Scy Tek TWN500 Used as an emulsifying agent for washing steps.
Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 Scy Tek PBD999
Protein LoBind Tube 2.0 mL Eppendorf Tubes 22431102 LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes.
Protein LoBind Tube 0.5 mL Eppendorf Tubes 22431064 LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes.
Microplate Devices UniSeal GE Healthcare 7704-0001 Used for sealing and storing functionalized plates.
Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom Costar 3370
HPLC grade water Sigma Aldrich 270733-4L
3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) Sigma Aldrich 381306-250MG Raman reporter
mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram Laysan Bio, Inc. MPEG-SH-5000-1g
OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram Laysan Bio, Inc. OPSS-PEG-SVA-5000-1g OPSS-PEG-SVA has an NHS end.
Mouse IgG, Whole Molecule Control Thermo Fisher Scientific 31903 Antigen
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher Scientific 31164 Antibody
Human Serum Albumin Blocking Solution Sigma Aldrich A1887-1G Bovine serum albumin can be used instead.
In-house built 785nm inverted Raman microscope unit N/A N/A An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used.
Mini Centrifuge Fisher Schientific 12-006-900
UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 2000c
UV-Vis Spectrophotometer BioTek Synergy 2
Desalting Columns Thermor Scientific 87766

References

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Cite This Article
Hanson, C., Israelsen, N. D., Sieverts, M., Vargis, E. Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform. J. Vis. Exp. (117), e54795, doi:10.3791/54795 (2016).

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