Фабрикации UV-VIS и спектроскопии комбинационного рассеяния света иммуноанализа платформы
Summary
Nanoparticle-based optical probes have been designed as a vehicle for detecting antigens using Raman and UV-Vis spectroscopy. Here we describe a protocol for preparing such probes for a UV-Vis/Raman spectroscopy immunoassay in such a way to incorporate future multiplexing capabilities.
Abstract
Иммунологические используются для обнаружения белков, основанные на присутствии ассоциированных антител. Из-за их широкого использования в исследованиях и клинических условиях, большая инфраструктура иммунологического инструментов и материалов можно найти. Например, 96- и 384-луночные полистироловые планшеты имеются в продаже и имеют стандартную конструкцию для размещения видимой области ультрафиолетового (УФ-Вид) спектроскопии машины от различных производителей. Кроме того, большое разнообразие иммуноглобулины, меток обнаружения и блокирующих агентов для индивидуальных конструкций иммунологического анализа, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) доступны.
Несмотря на существующую инфраструктуру, стандартные наборы ELISA не удовлетворяют все потребности исследований, требующих индивидуального развития иммунологического анализа, который может быть дорогостоящим и отнимает много времени. Например, ELISA наборы имеют низкую мультиплексирование (обнаружение более чем одного анализируемого вещества в то время) возможности, поскольку они, как правило, зависят от флуоресценции или Colкалориметрические методы обнаружения. Колориметрический и флуоресцентные на основе анализа имеют ограниченные возможности мультиплексирования из-за широких спектральных пиков. В противоположность этому, спектроскопии комбинационного рассеяния света на основе метода имеют гораздо больше возможностей для мультиплексирования из-за узких пиков выбросов. Еще одним преимуществом спектроскопии комбинационного рассеяния света является то , что комбинационные журналисты испытывают значительно меньше , чем фотообесцвечивания флуоресцентных меток 1. Несмотря на преимущества, которые комбинационные репортеры над флуоресцентных и колориметрических тегов, протоколы для изготовления комбинационного рассеяния на основе иммунологические ограничены. Целью данной работы является создание протокола для подготовки функционализированных зондов для использования в сочетании с пенополистирольных плит для непосредственного обнаружения аналитов с помощью УФ-Vis анализа и спектроскопии комбинационного рассеяния света. Этот протокол позволит исследователям принять сделай сам подход для будущего обнаружения мульти-аналита в то время как спекулируя на заранее установленной инфраструктуры.
Introduction
Типичные иммунологические сэндвич косвенно обнаружить присутствие антигена с использованием двух антител. Антитело захвата связан с твердой поверхностью и образует комплекс антитело-антиген, когда в непосредственной близости к соответствующему антигену. Антитело обнаружения затем вводят и связывается с антигеном. После промывания антитело / антиген / антитело остается и детектируют с помощью меченого антитела обнаружения , как показано на рисунке 1А. Типичное определение производится с помощью флуоресцентного или колориметрического детектора, ограничивая мультиплексирование до 10 аналитов из – за широких спектральных пиков 2,3. В отличие от систем на основе комбинационного имеют гораздо более узкие пики выбросов в результате чего расширенные возможности мультиплексирования с источниками претендующих на одновременное обнаружение до 100 аналитов 2,3.
Многие литературные источники доступны , которые охватывают важные аспекты , связанные с иммунологические тесты 4 – 6 таких , как шаг за шагомДетали для создания персонализированных наборов ELISA. К сожалению, эти протоколы для люминесцентной или колориметрического обнаружения, ограничивая возможности мультиплексирования специализированных иммуноанализа. Для удовлетворения этой потребности, мы представляем подробную процедуру для изготовления UV-VIS / комбинационное иммуноанализа , опубликованную ранее 7 для прямого иммуноанализа , как показано на рисунке 1В.
Этот протокол включает в себя изготовление функционализованный на основе наночастиц золота зондов, показанный на рисунке 2. Процедура , чтобы сделать / UV-VIS зондов комбинационного рассеяния начинает связыванием репортерам Рамана на поверхность наночастиц золота (AuNPs). Эти AuNPs затем функционализированные с антителами, которые связаны с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Остающиеся сайты связывания на AuNPs блокируют связывание метокси полиэтиленгликоль тиольных (мПЭГ-SH) к AuNPs для предотвращения последующего неспецифического связывания во время анализа. Подготовленные зонды AuNP тестируются путем связывания с антигенамиприкрепляемых к лункам полистирольной пластины , как показано на фигуре 1В. После промывания планшета в AuNP зонды детектируются с использованием УФ-видимой спектроскопии в то время как соответствующие комбинационные репортеры детектируются с спектроскопии комбинационного рассеяния света. Сочетание UV-VIS и КР спектральных данных обеспечивает два способа анализа, расширения возможностей этого иммунологического анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
В подробном протоколе, существует несколько критических точек обратиться. Одной из проблем является выбор репортера комбинационного и наночастиц золота. Хотя протокол был написан быть адаптирован для индивидуального использования, рамановские репортер DTTC был использован в качестве…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Research Catalyst Award from Utah State University. The authors would like to thank Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, and Donald Wooley for their contributions.
Materials
| 60nm Gold Nanoparticle | Ted Pella, Inc. | 15708-6 | These are citrate capped gold nanoparticles. Please see Discussion for relationship between Raman reporter and AuNP surface charge and its imporance to proper selection of AuNP and/or Raman reporter. |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Saline (10X) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| Bottle Top Filtration Unit | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Scy Tek | TWN500 | Used as an emulsifying agent for washing steps. |
| Phosphate Buffered Saline 10X Concentrate, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf Tubes | 22431102 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf Tubes | 22431064 | LoBind tubes prevent binding of proteins and AuNPs to surfaces of the tubes. |
| Microplate Devices UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | Used for sealing and storing functionalized plates. |
| Assay Plate, With Low Evaporation Lid, 96 Well Flat Bottom | Costar | 3370 | |
| HPLC grade water | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | Raman reporter |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1g | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 – 1 gram | Laysan Bio, Inc. | OPSS-PEG-SVA-5000-1g | OPSS-PEG-SVA has an NHS end. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | Antigen |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher Scientific | 31164 | Antibody |
| Human Serum Albumin Blocking Solution | Sigma Aldrich | A1887-1G | Bovine serum albumin can be used instead. |
| In-house built 785nm inverted Raman microscope unit | N/A | N/A | An inverted Raman microscope is best for proper focusing onto surface of the well plate. Otherwise a very low magnification will be used due to height of the 96-well plate. An in-house built system was used as it was cheaper than buying from a vendor. However, any commercially available inverted Raman microscope system can be used. |
| Mini Centrifuge | Fisher Schientific | 12-006-900 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis Spectrophotometer | BioTek | Synergy 2 | |
| Desalting Columns | Thermor Scientific | 87766 |
References
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582 (2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L. SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis. Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).
- . . The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques. , (2013).
- Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. Assay Guid. Man. , (2004).
- . . ELISA development guide. , (2016).
- Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate. J. Biol. Eng. 10, (2016).
- Menges, F. . Spekwin32 – optical spectroscopy software. Version 1.72.1. , (2016).
- Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays. AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).
- Yu, X. Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration. BioTechniques. 54, 257-264 (2013).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).
- . . EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline. 32. No 8, (2012).
- Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles. Plos One. 8 (4), e62084 (2013).
- Sinha, L. Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles. Sci. Rep. 5, 8582 (2015).
- Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment. J. Biomed. Opt. 19, 056014 (2014).
- Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells. Interface Focus. 3 (3), 20120092 (2013).
- McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm). Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).
