La aplicación de barreras impermeables combinadas con empapó las bolas Factor Candidato para el Estudio de señales inductivas en el polluelo

El siguiente protocolo utiliza embriones de pollo a menos de diez días de incubación. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el Kings College de Londres, Reino Unido y las pautas para el cuidado de los animales del Ministerio del Interior del Reino Unido. 1. se requiere preparación previa en Chick Embryo Operación Reúna los siguientes instrumentos quirúrgicos necesarios para las operaciones, para la cosecha y para la fijación de los embriones de pollo: Dos pares de pinzas de relojero Nº 5, un par de pinzas fuertes, por ejemplo, de tipo AA, tijeras curvadas, con hoja de 2,5 cm de largo, curvado extremos romos fórceps con extremos aproximadamente 0,5 cm de largo, y también dos pares de No. 4 pinzas de relojero para usar al hacer barreras de papel de aluminio (1.6.3). Hacer un cuchillo micro de un perno de acero (0,3 mm de diámetro) afiló usando el aceite en una piedra de afilar. El uso de un microscopio binocular, afilar la punta del pasador a una hoja plana. Coloque el pasador en un soporte de la aguja y proteger su extremo afilado de ser golpeado y dented. NOTA: Las envolturas el cuchillo con una punta de pipeta de 1.000 l es una opción simple para esto. Preparar etanol al 70% en una botella de lavado de plástico. Utilice un chorro de esto en un pañuelo de papel para limpiar los instrumentos quirúrgicos y el cuchillo micro antes y después de su uso para esterilizar y limpiar ellos. Compre 5 cm de ancho cinta adhesiva transparente y un dispensador adecuado. Encontrar o fabricar un descanso adecuado para contener un huevo de gallina constante en su lado. Marca y soluciones para almacenaje de granos de remojo. Preparar una solución de 0,35 mg / ml de proteína del factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF4) de 1 mg madre congelada / ml diluyendo con agua y se almacena a -20 ° C en alícuotas de 30 l. soluciones Preparar (ya sea 0,05 o 0,1 mg / ml) de todo-trans-retinoico ácido (RA) diluido con sulfóxido de dimetilo (DMSO) en tubos de microcentrífuga oscuros de una 5 mg / ml de stock. Almacenar el caldo y 100 ml de alícuotas a -20 ° C. Preparar soluciones (ya sea 2,5 o 5 mg / ml) de BMS 493 (un ag inversaperonista de los RAR) diluido con DMSO en tubos de microcentrífuga oscuros de un 10 mg / ml de stock. Almacenar el caldo y 100 ml de alícuotas a -20 ° C. Hacer barreras de papel de aluminio. NOTA: La lámina se utiliza para hacer las barreras es papel de catering estándar (medida por micrómetro como 0,013 mm de espesor). Cualquier papel de aluminio doméstico probablemente sería adecuado. Cortar un trozo cuadrado de 1 cm de papel de aluminio y esterilizarlo frotándola con un 70% de etanol en un tejido. Colocarlo en un 6 cm de plástico estéril placa de Petri. Desechar la tapa y hacer una tapa para el plato de papel de aluminio. NOTA: Esto evitará que las barreras de corte más tarde se pegue a la tapa de plástico de la placa debido a la estática. Coloque la placa de Petri en la parte superior de una retícula etapa (1 cm de largo se separaron en 100 secciones) bajo un microscopio binocular con un aumento ajustado a 1,6 veces. Usar una hoja No.15 pequeño bisturí, cortar tiras de la lámina a una anchura exacta, por ejemplo, 0,7 mm o 1,3 mm. Separar la láminatiras usando dos pares de pinzas de relojero Nº 4. A continuación, hacer una curva en ángulo recto en el centro de la barrera de lámina de tal manera que se asemeja a una bisagra de la anchura específica. NOTA: Esta forma de barrera se toma de 9, 10. Una barrera articulada se mantiene en su lugar mejor que una barrera recta y plana. Nº 4 fórceps son relativamente romo y se utilizan porque son menos propensos a hacer abolladuras o las puntuaciones en las barreras de papel de aluminio. Alineación de las barreras en el centro de la placa de Petri con un lado plano contra el plato y el otro hacia arriba fuera del plato, moviendo la lámina sin cortar restante a un lado. Preparar 20 o más barreras antes del día de la operación. Coloque la tapa de lámina sobre el plato y almacenar las barreras en un lugar donde no se verá afectado. NOTA: A pesar de un ligero golpe puede inclinar las barreras más o significar que se pegan con la estática de los lados del plato. Se incuban los huevos de gallina fertilizados en sus lados en bandejas de cartón de huevos a los 38 °C para la longitud de tiempo apropiado antes de día funcionamiento de modo que los embriones estará en el 8 etapa deseada. 2. Preparación del polluelo Los embriones y los granos en el Día de Operación 'Ventana' incuba los huevos de gallina. NOTA: El siguiente método para la apertura de los huevos fue transmitida por Dennis Summerbell (no publicado). Con el huevo acostado de lado, perforar el extremo romo (finales de los sacos aéreos) del huevo con unas pinzas tipo AA fuertes asegurándose de que la membrana de la cáscara interior se ha roto. Para ello captar la pinza firmemente juntos y usar un movimiento punzante controlada mientras sostiene el huevo con la mano libre. Tome el huevo, aún acostado de lado, con las dos manos (una a cada lado) convertirlo a través de 180 ° en el eje horizontal y sustituirlo en la bandeja de huevos de manera que el lado que era superior es ahora junto a la bandeja. NOTA: Esto afloja el embrión de las membranas de la cáscara y se significa que el embrión es less probable que se corte cuando se retira la carcasa por encima del embrión. Tome un pedazo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 5 cm cuadrados y se adhieren esta estrechamente sobre la superficie superior del huevo para detener la cáscara del huevo se desintegrara en el embrión cuando se abre el huevo. Use las tijeras curvas para romper suavemente a través de la cáscara y las membranas en el centro de la parte superior del huevo, hacer un agujero muy pequeño con una hoja de la tijera de modo que el aire pueda entrar en el huevo sobre el embrión (que se encuentra justo debajo la parte más superior de la cáscara). NOTA: Por simplemente rompiendo las membranas de la cáscara y no romper cualquiera de las membranas que cubren el embrión, el aire que entra en el huevo se separará el embrión de la cáscara y el embrión vendrá a descansar en la parte superior de la yema aproximadamente 0,5 a 1 cm de la cáscara . Use las tijeras curvas para agrandar el agujero en la cáscara de un círculo con un diámetro de aproximadamente 1 cm. Retire el trozo de cáscara extirpado y cubrir el agujero en el huevo con unapedazo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 5 cm cuadrados. Para retirar fácilmente esta cinta, presione la cinta para pegar sólo en el borde del agujero, dejando la cinta que queda libre. La cinta en blanco a continuación, puede ser comprendida de desprecintar el huevo. embriones en estadio de Después de incubación a 38 ° C (véase el paso 1.7) y de ventanas (paso 2.1), usar un microscopio binocular para organizar los embriones de pollo de acuerdo con 8. Hacer esto justo antes de que los huevos se sellan después de ventanas. Escribe la etapa de cada embrión en la cáscara del huevo. Devolver los huevos a la incubadora. NOTA: Los embriones en etapas entre 8 y 15 son apropiados para la barrera y de talón experimentos. Los embriones tienen más probabilidades de sobrevivir si no se han quedado fuera de la incubadora durante demasiado tiempo antes de la operación. perlas de remojo antes de la operación. FGF4 Tome el número de perlas de gel de cromatografía de afinidad (150 a 300 micras) que se adhieren a la final de una punta de pipeta 1.000 l y estabah en 1 ml de buffer fosfato salino (PBS) en un tubo de microcentrífuga para eliminar la azida que se almacenan en. Centrifugar durante 5 seg, desechar el PBS y se repite el proceso dos veces. Remojar las perlas de gel en una caída de 30 l de 0,35 mg de proteína FGF4 / ml en una placa de Petri estéril en hielo durante 30 min. Recoger los granos de aproximadamente 150 micras de diámetro con No. 5 microforceps para la inserción en el embrión. NOTA: la manija perlas de resina de intercambio iónico usadas en los siguientes pasos con el número 5 y microforceps agarre ellos muy suavemente porque las perlas son frágiles y pueden romperse si exprimido con demasiada fuerza. Esta advertencia se aplica a todas las operaciones y 2.3.2-2.3.3 perla de resina. REAL ACADEMIA DE BELLAS ARTES Descongelar una alícuota de 0,05 o 0,1 mg / ml, todo-trans-RA diluye con DMSO y se coloca una gota de 100 l en una placa de Petri estéril (9 cm de diámetro), que ha sido previamente cubierto de papel de aluminio para proteger la RA de la luz. Tome una punta de pipeta de 10 l y recoger un poco de intercambio iónico en forma de cloruroperlas de resina en su extremo y tomar estos en la caída de RA protegido de la luz a temperatura ambiente durante 20 min. Enjuagar las perlas en tres gotas sucesivas de 100 l de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) colocados en el mismo plato Petri al menos 1 cm de separación. NOTA: Las perlas ocupan el colorante rojo de fenol de la DMEM. Este método se basa en 5. Recoger los granos de aproximadamente 100 micras de diámetro (perlas varían en tamaño desde 75 hasta 180 micras cuando está mojado) para la inserción en el embrión, el uso de un portaobjetos de retícula platina del microscopio bajo los microforceps placa de Petri y No.5 para contener las perlas. Al recoger el talón de la caída de 100 l de DMEM, primero lugar el cordón hacia abajo sobre la placa de Petri y eliminar cualquier DMEM restante de ella, ya sea por empujando el cordón fuera de la gota o mediante la colocación de las pinzas cerradas al lado del talón (capilar acción se basa el líquido lejos de la perla). BMS 493 En cuanto a la AR (2.3.2), en remojo interc ionesperlas de resina ange en una caída de 100 l de 2,5 o 5,0 mg / ml BMS 493 en DMSO a temperatura ambiente durante 20 min y después se enjuagan en 100 gotas mu l de DMEM. Recoger los granos de aproximadamente 100 micras de diámetro para la inserción en el embrión. control de DMSO En cuanto a la RA (2.3.2), en remojo perlas de resina de intercambio iónico en una caída de 100 l de DMSO a temperatura ambiente durante 20 min y luego enjuague en 100 gotas mu l de DMEM. Recoger los granos de aproximadamente 100 micras de diámetro para la inserción en el embrión. 3. Operaciones de barrera y del grano Figura 1. Esquema de embriones de polluelo diversas etapas que muestra dónde y Barreras o los granos deben ser colocados. (A) Etapa 13 embriones de pollo esquema que muestra la posición de barrera (línea verde) entre somitas y LPM en la presunciónAla Nivel tiva (somitas 15-20). (B) El mismo esquema que en (A), lo que indica donde cordón de RA (círculo rojo) se debe colocar antes de la inserción de barrera. (C) Esquema que muestra la posición de barrera (línea verde) a nivel de la pierna presuntiva (somitas 26-32) en un embrión en la etapa 15. (D) El mismo esquema que en (C), lo que indica donde un cordón de RA (círculo rojo) debe ser colocado. (E) Esquema que indica donde BMS 493 perlas (círculos de color púrpura) se deben colocar en la LPM de un embrión de etapa 15. (F) Diagrama esquemático de una etapa 9 embrión de pollo que indica la posición de barrera (línea verde) entre el mesodermo y presomitic LPM a nivel del ala presuntiva. (G) Diagrama esquemático de un embrión de etapa 9, que muestra las posiciones de una barrera (línea verde) y bolas de RA (círculo rojo). (H) Esquema de un embrión de pollo etapa 10, que muestra la posición de barrera (línea verde) a nivel de la pierna presuntiva. (I </strong>) Diagrama esquemático que muestra BMS 493 posición de talón (círculo morado) en la etapa 10 LPM nivel de la pierna. Esta cifra ha sido modificado a partir de 7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Barrera inserta en la etapa 13 para evitar la iniciación del brote ala. Tomar un embrión de etapa 13 de la incubadora y colocar el huevo en un resto de huevo con un microscopio binocular se establece en 3,2X aumentos o más si se prefiere. Eliminar la capa superior de cinta adhesiva transparente. Usando un cuchillo de acero micro, hacer una incisión a través de la membrana vitelina y lateral placa mesodermo (LPM) adyacente a somitas 15 a 20 (Figura 1A) en el lado derecho del embrión (somitas no todos han formado en esta etapa). Cortar adyacente a los últimos cuatro somitas formados y continuar el corte dos longitudes somite en sentido caudal. Recoge la barrera (0.7-1 mm de ancho) con el número 5 MICROFOrceps en el extremo que sobresale de la placa de Petri y torcer la mano para insertar el extremo libre de la barrera en la incisión. La barrera en forma de bisagra quede plana sobre la membrana vitelina por encima de la LPM con medio de ella que sobresale hacia abajo a través de la incisión distal a los somitas. Tan pronto como sea posible sellar el huevo con cinta adhesiva transparente y devolverlo a la incubadora. NOTA: El cuchillo micro y fórceps convertirse en pegajosa en contacto con la membrana vitelina. Es importante limpie con etanol al 70% antes de intentar una operación posterior. Esto se aplica a todas las descripciones de las operaciones posteriores a talón y implantaciones. Si un cordón se va a insertar en conjunción con una barrera; En primer lugar, tomar el grano en el número 5 microforceps y la inserta en la cara de corte de la LPM en la parte distal de la incisión y luego insertar la barrera en la parte proximal de la incisión a la perla (Figura 1B). Sellar el huevo y devuelvan lo antes posible a la incubadora. </li> Barrera inserta en la etapa 15 para evitar la iniciación del brote de la pierna. NOTA: Un ejemplo del resultado de esta operación en Tbox 4 factor de transcripción la expresión (Tbx4) se muestra en la Figura 2D y 2E. Tomar un embrión de etapa 15 de la incubadora y colocar el huevo en un resto de huevo con un microscopio binocular se establece en 3,2X aumentos o más si se prefiere. Eliminar la capa superior de cinta adhesiva transparente. Usando un cuchillo de acero micro hacer una incisión a través de la membrana vitelina y LPM adyacente a somitas 26 a 32 (Figura 1C) en el lado derecho del embrión (somitas no todos han formado en esta etapa). Cortar adyacente a los dos últimos formados somitas y continuar el corte cinco longitudes somite en sentido caudal. Recoge la barrera (1,2-1,3 mm de ancho) con el número 5 microforceps en un extremo y torcer la barrera para insertar el extremo libre en la incisión. Tan pronto como sea posible sellar la clara de huevo con cinta de unand devolverlo a la incubadora. NOTA: La bisagra en forma de barrera se encuentra plana sobre la membrana vitelina por encima de la LPM con medio de ella que sobresale hacia abajo a través de la incisión distal a los somitas. Si una gota se va a insertar en conjunción con una barrera, en primer lugar, tomar el grano en el número 5 microforceps y la inserta en la cara de corte de la LPM en la parte distal de la incisión y luego insertar la barrera en la parte proximal de la incisión el talón (Figura 1D). Sellar el huevo y devuelvan lo antes posible a la incubadora. Si una perla o perlas se van a insertar sin una barrera, por ejemplo, BMS 493 cuentas a la región de la pierna en la etapa 15, no hacen la larga incisión (3.2.2.1). Hacer una pequeña incisión a través de la membrana vitelina y en el LPM en la posición de la perla se va a colocar. Tome el cordón en el número 5 microforceps y la inserta en el agujero de la LPM. Empujarlo en un poco más con los extremos cerrados de las pinzas (Figura 1E). </li> Barrera inserta en la etapa 9 para evitar la inducción del brote del ala y la iniciación. Tome una etapa 8 o 9 embrión de la incubadora y colocar el huevo en un resto de huevo con un microscopio binocular se establece en 3,2X aumentos o más si se prefiere. Usando un cuchillo de acero micro hacer una incisión a través de la membrana vitelina y LPM lateral y rostral a la línea primitiva, en el extremo caudal del embrión en línea con las somitas (Figura 1F) sobre 5 somite grandes longitudes. Recoger la barrera (0.7-1 mm de ancho) con el número 5 microforceps en el extremo que sobresale de la placa de Petri y torcer la mano para insertar el extremo libre de la barrera en la incisión. Tan pronto como sea posible sellar el huevo con cinta adhesiva transparente y devolverlo a la incubadora. NOTA: La bisagra en forma de barrera se encuentra plana sobre la membrana vitelina por encima de la LPM con medio de ella que sobresale hacia abajo a través de la incisión. Si un grano es ser INSERTEd en combinación con una barrera; En primer lugar, tomar el grano en el número 5 microforceps y la inserta en la cara de corte de la LPM en la parte distal de la incisión y luego insertar la barrera en la parte proximal de la incisión a la perla (Figura 1G). Sellar el huevo y devuelvan lo antes posible a la incubadora. Barrera inserta en la etapa 10 para evitar la inducción del brote de la pierna y la iniciación. NOTA: Un ejemplo del resultado de esta operación en la expresión Tbx4 se muestra en la figura 2G. Tomar un embrión de etapa 10 de la incubadora y colocar el huevo en un resto de huevo con un microscopio binocular se establece en 3,2X aumentos o más si se prefiere. Usando un cuchillo de acero micro hacer una incisión a través de la membrana vitelina y LPM lateral a la línea primitiva, en el extremo caudal del embrión en línea con las somitas (Figura 1H) aproximadamente 6 somite grandes longitudes. Recoge la barrera (1.2mm de ancho) con el número 5 microforceps en el extremo que sobresale de la placa de Petri y torcer la mano para insertar el extremo libre de la barrera en la incisión. Tan pronto como sea posible sellar el huevo con cinta adhesiva transparente y devolverlo a la incubadora. NOTA: La bisagra en forma de barrera se encuentra plana sobre la membrana vitelina por encima de la LPM con medio de ella que sobresale hacia abajo a través de la incisión. Si un cordón se va a insertar sin una barrera, por ejemplo, BMS 493 cordón a la región de la pierna en la etapa 10, hacer una pequeña incisión a través de la membrana vitelina y en el LPM en la posición de la perla se va a colocar. Tome el cordón en el número 5 microforceps y la inserta en el agujero de la LPM. Empujarlo en un poco más con los extremos cerrados de las pinzas (Figura 1I). 24 horas o más después de operar a comprobar la posición de la barrera en comparación con la yema de la extremidad contralateral emergente. Descarte cualquier embriones en el que la barrera no es claramente Oposite la yema de la extremidad izquierda. En este caso, la barrera ha sido colocado erróneamente. 4. La recolección de embriones, Fijación y preparación para Wholemount de hibridación in situ (deseo) embriones post cosecha operación. embriones de la cosecha en la etapa 19 a 23 de tal manera que la morfología de yema del miembro es claramente visible tanto en los lados de control operados y contralateral. Con unas tijeras curvas cortan un agujero más grande en la cáscara del huevo. Corte alrededor del embrión mientras sostiene el vaso sanguíneo grande a la izquierda del embrión con microforceps. Use este agarre del recipiente para eliminar el embrión y colocarlo en una placa de Petri de tampón fosfato salino (PBS) pH 7,3. Bajo un microscopio binocular, diseccionar vasos embrionarios adicionales y las membranas utilizando una combinación de tijeras curvas y no. 5 microforceps. Retire el cabezal con las tijeras. La fijación de los embriones post-cosecha. Usando Blun curvadat fórceps, levantar el embrión y lo colocan en 5 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS a temperatura ambiente durante dos horas y luego mecedora a 4 ° C durante la noche en una botella de vidrio de 20 ml con tapón de rosca. Precaución: PFA es un peligro grave para la salud. Es un irritante nocivo, corrosivo y el polvo se debe evitar que entren en contacto con la piel, los ojos y los pulmones. Usar ropa de protección personal y una campana de humos mientras se prepara la solución. Una vez que se trata de una solución al 4%, guantes, gafas protectoras y una bata de laboratorio deben ser puestas. NOTA: Es importante obtener los embriones en solución rápidamente para mejor preservar la integridad del ARNm. La eliminación de las barreras antes de wholemount hibridación in situ. NOTA: Se eliminan las barreras, ya que son afilados y pueden dañar embriones a medida que avanzan a través del protocolo de hibridación in situ, especialmente si varios embriones se tiñeron a la vez. Después de la fijación, colocar el embrión en un plato de PBS con arreglo a mi binocularcroscope. El uso de dos pares de No. 5 microforceps, colocar el par izquierdo de cerca cada lado de la barrera en el lado operado del embrión. Agarre la barrera con el par y tirar suavemente de la barrera del embrión usando el par de la izquierda para mantener el embrión hacia abajo y para evitar cualquier tejido se adhiera a la barrera, ya que se elimina. Llevar a cabo DESEO esencialmente como se describe en el 11.