チックに誘導シグナルを研究するために、候補因子浸しビーズと組み合わせることで不浸透性の障壁の応用

以下のプロトコルは、インキュベーションの10日以内でニワトリ胚を使用しています。全ての実験は、キングス・カレッジ・ロンドン、英国、英国内務省動物保護ガイドラインに従って行われました。 前ニワトリ胚の操作に必要な1.準備収穫のためにとニワトリ胚を固定するため、操作に必要な以下の手術器具を収集：5号時計メーカー2対の鉗子、強力な鉗子の一組、 例えば 、AA型、長さ2.5cmブレードを備えた湾曲はさみ、ブラントは、湾曲終了箔障壁（1.6.3）をしながら、約0.5センチメートル長い端部を有する鉗子、また、第4時計職人の鉗子の2ペアが使用しています。 スチールピン（全体の0.3ミリメートル）からマイクロナイフを作る研ぎ石の上に油を使用して先鋭化。双眼顕微鏡を使用して、フラットブレードにピンの先端をシャープに。針ホルダーにピンを配置し、その鋭いノックされるの終わりとdenを守りますテッド。 注：1,000μlのピペットチップでナイフをシースは、このための簡単なオプションです。 プラスチック洗浄瓶に70％エタノールを準備します。殺菌し、それらをきれいにするために使用前と後の手術器具およびマイクロナイフを拭くためにティッシュペーパーでこのの噴出を使用してください。 幅5cm明確な粘着テープおよび適切なディスペンサーを購入します。その側に安定した鶏の卵を保持するのに適した残りの部分を見つけるか、または製造しています。 ビーズを浸漬のために作ると店舗ソリューションを提供しています。 30μlのアリコートで-20℃で水とストアでそれを希釈することによって1mg / mlの凍結ストックからの線維芽細胞増殖因子4（FGF4）タンパク質の0.35 mg / mlで溶液を調製します。 調製溶液を5mg / mlのストックから暗いマイクロ遠心チューブ内のジメチルスルホキシド（DMSO）で希釈し、全トランスレチノイン酸（RA）の（いずれか0.05または0.1 mg / mlで）。 -20℃でストックし、100μlのアリコートを保管してください。 準備ソリューションBMS 493の（どちらか2.5または5 mg / mlで）（逆AG10mg / mlストックから暗いマイクロ遠心チューブにDMSOで希釈したRARのonist）。 -20℃でストックし、100μlのアリコートを保管してください。 アルミ箔から障壁を作ります。 注：障壁を作るために使用される箔は（0.013ミリメートルの厚さとしてマイクロメーターで測定して）標準ケータリング箔です。どれでも国内のアルミ箔は、おそらく適切であろう。 アルミ箔1cmの正方形の部分をカットし、組織上の70％エタノールでそれを拭いて、それを殺菌。 6センチメートル滅菌プラスチックペトリ皿の上に置きます。ふたを捨て、箔から皿のために蓋をします。 注：これは、後に静に皿のプラスチックの蓋に付着カット障壁を防ぐことができます。 1.6倍に設定倍率の双眼顕微鏡下のステージ目盛り（100セクションに長さ1cmのスプリット）の上にペトリ皿を置きます。 15番ブレード小さなメスを用いて、 例えば 、正確な幅に0.7ミリメートルまたは1.3ミリメートルの箔のストリップをカット。 箔を分離4番時計職人の鉗子の2ペアを使用してストリップ。そして、それは特定の幅のヒンジに似ているように、箔障壁の中心に直角曲げを行います。 注：バリアのこの形状は、 図9に示すように、10から取り出されます。ヒンジ付きの障壁は、ストレート、フラットバリアよりもより良い場所に留まります。第4鉗子は比較的鈍いであり、それらはフォイル障壁にへこみやスコアを作る可能性が低いため、使用されています。 皿や他の一方の側に残りノーカット箔を移動する、皿の外に上向きに対して平らに片側でペトリ皿の中央に障壁ラインアップ。操作前日20以上の障壁を準備します。皿の上に箔の蓋を置き、彼らが邪魔されない場所での障壁を格納します。 注：わずかなノックが終わっ障壁を傾けるか、皿の側面に静的に固執することを意味することができます。 38℃で段ボールの卵トレイにその両側に受精鶏卵をインキュベート操作前日適切な時間の長さCは、胚が目的の8段階になりますように。 ニワトリ胚および運用日にビーズの作製 「ウィンドウ」は鶏の卵をインキュベートしました。 注：卵を開くための次のメソッドは、デニスSummerbellによって渡された（公開されません）。 卵がその側に横たわっていると、AA型の強力な鉗子は、内卵殻膜が破壊されていることを確認することで卵の鈍端（気嚢の端を）突き刺します。これを行うためには、しっかりと一緒に鉗子を把握し、フリーハンドで卵を保持したまま制御刺すような動きを使用しています。 まだ水平軸に沿って180°を通してそれをオンにし、最上た側は次のトレイに今あるような卵トレイにそれを置き換える（1どちらかの側）の両方の手で、その側に横たわって、卵を取ります。 注：これは、シェル膜から胚を緩めると胚がルであることを意味します胚上記シェルが除去されたときに切断される可能性が高いSS。 約5cmの正方形明確なテープ片を取り、卵が開かれたときに、胚に崩壊しつつあるから卵殻を停止するには、卵の最表面に密接にこれを貼り付けます。 すぐ下に位置している空気が胚の上に卵を入力できるように優しくシェルと卵の最上部の中央にその膜を打破するために湾曲したハサミを使用して、（はさみの一つのブレードと非常に小さな穴を作りますシェルの最上部）。 注：ちょうど胚をカバーする膜のいずれかを壊すシェル膜を破壊しないことで、卵に入る空気は、シェルから胚を分離し、胚が約0.5〜1センチメートルシェルから卵黄の上に残りの部分に来ます。 約直径1cmの円形に殻に穴を拡大するために湾曲したハサミを使用してください。と卵に穴を切除したシェルの一部を削除し、カバー明確なテープ片約5cmの正方形。簡単にこのテープを削除するには、無料の残りのテープを残し、唯一の穴の唇でそれを固執するテープを押してください。空きテープは、その後、卵を開封するために把握することができます。 ステージの胚 38°Cとウィンドウ（ステップ2.1）（ステップ1.7を参照）でのインキュベーションに続いて、8に従ってニワトリ胚をステージングする双眼顕微鏡を使用しています。卵は、ウィンドウ以下の密封されている直前にこれを行います。卵殻上の各胚のステージを書きます。インキュベーターに卵を返します。 注：8と15の間の段階で胚が障壁とビーズの実験に適しています。彼らはあまりにも長い間、動作前にインキュベーターから除外されていない場合は胚が生き残る可能性が高くなります。 操作前にビーズを浸します。 FGF4 千μlのピペットチップの先端に固執アフィニティークロマトグラフィーゲルビーズの数（150-300μm）を取るとしましたマイクロ遠心チューブ内の1mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中のHそれらは、それらが5秒間。遠心分離に格納されているアジドを除去し、PBSを廃棄し、二度の処理を繰り返します。 氷上で30分間滅菌したシャーレ上で0.35 mg / mlでFGF4タンパク質の30μlのドロップにゲルビーズを浸します。胚に挿入するための第5マイクロピンセットでビーズを約150μmの直径を選択してください。 注：ビーズは脆く、きつく絞った場合に粉々にすることができるので、第5マイクロピンセットと非常に軽く握り、それらを用いて、以下の手順で使用されるイオン交換樹脂ビーズを処理します。この警告は、2.3.2-2.3.3、すべての樹脂ビーズの操作に適用されます。 RA 0.05または0.1 mgの一定分量を解凍/オールトランスRAは、DMSOで希釈し、以前に光からRAを保護するためにホイルでカバーされた滅菌ペトリ皿（直径9cm）、に100μlのドロップを置きmLです。 10μlのピペットチップを取り、いくつかの塩化物型のイオン交換を拾いますその端部に樹脂ビーズと20分間室温で光から保護RAドロップこれらを浸します。 1cm以上離れた同じシャーレ上に配置された100μlのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の連続する3つの滴中でビーズを洗浄します。 注：ビーズはDMEMからフェノールレッド色素を取ります。この方法は、5に基づいています。 ビーズを保持するためにペトリ皿と5番マイクロピンセットの下顕微鏡ステージの目盛りのスライドを使用して胚に挿入するため、約100μmの直径（湿潤時ビーズは75から180ミクロンのサイズの範囲）のビーズを選んでください。ペトリ皿の上に100μlのDMEMのドロップ、ビーズダウン最初の場所からのビーズをピックアップし、ドロップのうち、ビーズを押すことによって、またはキャピラリー（次のビーズに、閉じた鉗子を置くことによって、どちらかそれから残りのDMEMを削除する場合アクションは）ビーズから離れた液体を描画します。 BMS 493 RA（2.3.2）に関しては、イオンEXCHを浸します20分間、室温で2.5または5.0 mgを100μlの滴/ mlのDMSO中BMS 493でアンジュ樹脂ビーズは、その後、DMEM100μlの滴ですすぎます。胚に挿入するためのビーズ約100μmの直径を選択してください。 DMSOコントロール RA（2.3.2）については、DMEM100μlの滴ですすぎ、次いで20分間室温で、DMSOの100μl滴中のイオン交換樹脂ビーズを浸します。胚に挿入するためのビーズ約100μmの直径を選択してください。 3.バリアとビーズの操作 図障壁およびまたはビーズが置かれるべき場所を示す様々な段階のニワトリ胚の1回路図。 presumpで体節とLPMの間（A）ステージ13ニワトリ胚を示す概略図バリア位置（グリーンライン）的なウイングレベル（体節15-20）。 RAビーズ（赤い円）は、バリア挿入の前に置かれるべき場所を示す（B）（A）と同じ概略図。 （C）ステージ15胚における推定脚レベル（体節26-32）で示す概略図バリア位置（緑の線）。 （D）（C）の場合と同様の模式、RAビーズ（赤い円）が置かれるべき場所を示します。 （E）の回路図BMS 493ビーズ（紫円）はステージ15胚のLPMに置かれるべき場所を示します。 （F）推定ウイングレベルで前体節中胚葉とLPMの間の障壁の位置（緑色の線）を示すステージ9ニワトリ胚の模式図。 （G）バリア（緑線）とRAビーズ（赤い円）の位置を示すステージ9の胚の模式図。 （H）推定脚レベルでバリア位置（緑の線）を示すステージ10ニワトリ胚の模式図。 （I </st栄>）ステージ10脚レベルLPMにBMS 493ビーズの位置（紫円）を示す模式図。この図7から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 バリアは、翼の芽の開始を防止するために、ステージ13に挿入します。 インキュベーターからステージ13胚を取り、3.2倍の倍率又は好ましい場合以上に設定双眼顕微鏡下で卵の残りの部分に卵を置きます。明確なテープの上層を削除します。 （体節がすべてのこの段階で形成されていない）スチールマイクロナイフを使用して、胚の右側の卵黄膜と体節に隣接する側板中胚葉（LPM）15〜20（ 図1A）を介して切開を行います。形成された最後の4つの体節に隣接してカットし、尾側にカット2体節長を続けています。 第5 microfoで（0.7〜1ミリメートル幅）障壁をピックアップペトリ皿から突出端にrcepsと切開部に障壁の自由端部を挿入するために手をねじります。ヒンジ状のバリアはそれの半分は体節の遠位に切開部を通して下方に突出してLPM上記の卵黄膜上に平らに。できるだけ早く明確なテープで卵を密封し、インキュベーターに戻します。 注：マイクロナイフとピンセットは、卵黄膜と接触すると粘着性になります。その後の操作を試みる前に、70％エタノールできれいに拭いてくださいすることが重要です。これは、後続のすべての操作の説明をし、ビーズ注入に適用されます。 ビーズは、バリアと一緒に挿入される場合、まず、第5マイクロピンセットでビーズを取り、切開部の先端側にLPMの切断面に挿入した後、ビーズ（ 図1B）に切開近位にバリアを挿入します。卵を密封し、インキュベーターに速やかにそれを返します。 </li> バリアは、脚の芽の開始を防止するために、ステージ15に挿入します。 注：TBOX 4転写因子 （Tbx4）発現に対するこの操作の結果の例を図2Dおよび2Eに示されています。 インキュベーターからステージ15の胚を取り、3.2倍の倍率又は好ましい場合以上に設定双眼顕微鏡下で卵の残りの部分に卵を置きます。明確なテープの上層を削除します。 鋼マイクロナイフを使用すると、胚の右側に体節26から32（ 図1C）に隣接した卵黄膜とLPMを通して切開を作る（体節は、この段階で形成されていないすべてを持っています）。形成された最後の2体節に隣接してカットし、尾側にカット5体節長を続けています。 一方の端部に第5マイクロピンセットで（1.2〜1.3ミリメートル幅）障壁をピックアップし、切開部に自由端を挿入するバリアをねじります。できるだけ早く明確なテープAと卵を封印NDインキュベーターに戻します。 注：ヒンジ状のバリアはそれの半分は体節の遠位に切開部を通して下方に突出してLPM上記の卵黄膜上に平らに。 ビーズは、バリアと一緒に挿入される場合、まず、第5マイクロピンセットでビーズを取り出し、切開部の先端側にLPMの切断面に挿入し、その後に切開近位側にバリアを挿入しますビーズ（ 図1D）。卵を密封し、インキュベーターに速やかにそれを返します。 ビーズやビーズはバリアなしで挿入される場合は、脚の領域に、例えば 、BMS 493ビーズステージ15で、長い切開（3.2.2.1）をしないでください。卵黄膜を通って、ビーズが配置される位置でのLPMに小さな切開を行います。第5マイクロピンセットでビーズを取り、LPMの穴に挿入します。鉗子（ 図1E）の閉鎖端部ともう少しでそれを押してください。 </李> バリアは、翼の芽の誘導と開始を防止するためにステージ9に挿入します。 ステージ8やインキュベーターから9胚を取り出し、好適な場合には3.2倍の倍率以上に設定双眼顕微鏡下で卵の残りの部分に卵を置きます。 鋼マイクロナイフを使用すると、約5体節の長さの長い体節（ 図1F）に沿った胚の尾終わりに、原始線条に横方向と吻側卵黄膜とLPMを通して切開を作ります。 ペトリ皿から突出端に第5マイクロピンセットで（0.7〜1ミリメートル幅）障壁をピックアップし、切開部に障壁の自由端部を挿入するために手をねじります。できるだけ早く明確なテープで卵を密封し、インキュベーターに戻します。 注：ヒンジ状のバリアはそれの半分は切開部を通して下方に突出してLPM上記の卵黄膜上に平らに。 ビーズはinserteにする場合バリアと一緒にD;まず、第5マイクロピンセットでビーズを取り、切開部の先端側にLPMの切断面に挿入した後、ビーズ（ 図1G）に切開近位にバリアを挿入します。卵を密封し、インキュベーターに速やかにそれを返します。 バリアは、脚の芽の誘導と開始を防止するために、ステージ10に挿入します。 注：Tbx4発現に対するこの演算の結果の一例を、 図2Gに示されています。 インキュベーターからステージ10胚を取り、3.2倍の倍率又は好ましい場合以上に設定双眼顕微鏡下で卵の残りの部分に卵を置きます。 鋼マイクロナイフを使用すると、約6体節の長さの長い体節（ 図1H）に沿った胚の尾終わりに、原始線条に横卵黄膜とLPMを通して切開を作ります。 バリアピックアップ（1.2ペトリ皿から突出末端で第5マイクロピンセットで広いミリメートル）と切開部に障壁の自由端部を挿入するために手をねじります。できるだけ早く明確なテープで卵を密封し、インキュベーターに戻します。 注：ヒンジ状のバリアはそれの半分は切開部を通して下方に突出してLPM上記の卵黄膜上に平らに。 ビーズは、ステージ10における脚部の領域に、例えば、BMS 493ビーズ、バリアなしで挿入される場合には、卵黄膜を介して小切開を行い、ビーズが配置される位置でのLPMに。第5マイクロピンセットでビーズを取り、LPMの穴に挿入します。鉗子（ 図1I）の閉鎖端部ともう少しでそれを押してください。 新興対側肢芽と比べてバリアの位置を確認して操作した後24時間以上。障壁が明らかにopposではない任意の胚を破棄左肢芽をITE。この場合、障壁は、誤って配置されています。 4.収穫胚、in situハイブリダイゼーションホールマウント用の固定と準備（WISH） 収穫の胚操作を投稿してください。 ステージ19-23で収穫胚肢芽の形態が明確に両方の操作と反対側のコントロール側に表示されるようになっています。 湾曲したハサミを使用すると、卵殻に、より大きな穴をカット。マイクロピンセットを持つ胚の左側に大血管を保持しながら、胚の周りにカットします。胚を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.3のペトリ皿に配置するために血管のこのグリップを使用します。 双眼顕微鏡下では、湾曲したハサミなしの組み合わせを用いて、胚体外血管および膜を離れて解剖。 5マイクロピンセット。はさみを使ってヘッドを取り外します。 胚の固定は、収穫を投稿してください。 湾曲したblunを使用しましたトンの鉗子は、胚を持ち上げ、スクリューキャップで20ミリリットルのガラス瓶に揺動した後、4℃で一晩2時間室温でPBSで5ミリリットルの4％パラホルムアルデヒド（PFA）に配置します。 注意：PFAは、健康に深刻な危険です。それは有害な、腐食性刺激性であり、粉末は眼や皮膚、肺に接触することを防止しなければなりません。溶液を調製しながら、個人的な保護服とヒュームフードを使用してください。それは4％水溶液、手袋、目の保護と白衣を着用する必要がありたら。 注：これは最高のmRNAの完全性を維持するために迅速に修正に胚を取得することが重要です。 in situハイブリダイゼーションホールマウントする前に障壁を除去します。 注：彼らはシャープであり、それらはin situハイブリダイゼーションプロトコルを介して行くように胚を損傷することがありますので、障壁は、いくつかの胚を一度に染色されている場合は特に、削除されます。 固定後、両眼マイルの下でPBSの皿に胚を置きますcroscope。 第5マイクロピンセットの2ペアを使用して、胚の操作側に密接バリアのいずれかの側を左のペアを配置します。左右一対でバリアをつかみ、静かに胚を抑えるために、それが除去されるように、バリアに付着する任意の組織を防止するために、左のペアを使用して、胚からバリアを引き出します。 11で説明したように、本質的WISHを行います。