Toepassing van Waterdicht Barrières In combinatie met de kandidaat-Factor Soaked Beads om Inductive Signalen studie in de Chick

Het volgende protocol gebruikt kippenembryo's minder dan tien dagen incubatie. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de King's College in Londen, het Verenigd Koninkrijk en het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken richtlijnen voor de verzorging van dieren. 1. Voorbereiding vereist voor Embryo Operation Chick Verzamel de volgende chirurgische instrumenten die nodig zijn voor de operaties, voor het oogsten en voor de vaststelling van de kippenembryo's: Twee paren No. 5 horlogemakers pincet, een paar sterke tang, bijvoorbeeld, type AA, gebogen scharen met bladen 2,5 cm lang, stomp gebogen pincet met eindigt circa 0,5 cm lang, en ook twee paren van No. 4 horlogemakers een tang om te gebruiken tijdens het maken van folie barrières (1.6.3). Maak een micro mes uit een stalen pin (0,3 mm in diameter) aangescherpt met behulp van olie op een slijpsteen. Met behulp van een binoculair microscoop, verscherpen de punt van de pen op een platte. Plaats de pin in een naaldhouder en zijn scherpe uiteinde te beschermen tegen geklopt en dented. LET OP: omhullingen het mes met een 1000 ui pipet tip is een eenvoudige optie voor deze. Bereid 70% ethanol in een plastic spuitfles. Gebruik een spuit dit op een papieren tissue op de chirurgische instrumenten en de micro mes afvegen voor en na gebruik te steriliseren en reinigen. Koop 5 cm breed duidelijke plakband en een geschikte dispenser. Vind of vervaardiging van een rust geschikt is om een ​​kippenei stevig op zijn kant te houden. Maken en op te slaan oplossingen voor het weken kralen. Bereid een 0,35 mg / ml oplossing van Fibroblastengroeifactor 4 (FGF4) proteïne uit 1 mg / ml bevroren voorraad door verdunnen met water en bewaar bij -20 ° C in 30 pi aliquots. Bereid oplossingen (ofwel 0,05 of 0,1 mg / ml) van all-trans-retinoïnezuur (RA) verdund met dimethylsulfoxide (DMSO) in donkere microcentrifugebuizen van een 5 mg / ml voorraad. Bewaar de bouillon en 100 ul fracties bij -20 ° C. Bereid oplossingen (hetzij 2,5 of 5 mg / ml) van BMS 493 (een inverse agonist van RAR) verdund met DMSO in donkere microcentrifugebuizen van een 10 mg / ml voorraad. Bewaar de bouillon en 100 ul fracties bij -20 ° C. Maak barrières van aluminiumfolie. LET OP: De folie wordt gebruikt om de barrières te maken is standaard catering folie (gemeten door micrometer als 0,013 mm dik). Elke binnenlandse aluminiumfolie zou waarschijnlijk geschikt. Snij een 1 cm vierkant stuk aluminiumfolie en steriliseren schoon met 70% ethanol op een tissue. Plaats het op een 6 cm steriele plastic petrischaal. Gooi het deksel en maak een deksel voor het gerecht uit folie. LET OP: Dit voorkomt dat de cut barrières van later vasthouden aan de plastic deksel van de schaal als gevolg van statische. Plaats de petrischaal op een trap graticule (1 cm lang verdeeld in 100 delen) onder een binoculaire microscoop met vergroting op 1,6X. Met behulp van een No.15 mes kleine scalpel, snijd stroken van de folie om een exacte breedte, bijvoorbeeld, 0,7 mm of 1,3 mm. Scheid de foliestrips met behulp van twee paren van No. 4 horlogemakers pincet. vervolgens een haakse bocht in het midden van de folie afsluiting zodanig dat het lijkt op een scharnier van de bepaalde breedte. LET OP: Deze vorm van de barrière wordt genomen uit 9, 10. Een scharnierende barrière op zijn plaats blijft beter dan een rechte, vlakke barrière. No. 4 forceps relatief stompe en worden gebruikt omdat ze minder waarschijnlijk deuken of groeven te maken in de folie barrières. Line-up van de barrières in het midden van de petrischaal met de ene kant plat tegen het gerecht en de andere wijzen omhoog uit de schotel, het verplaatsen van de overgebleven uncut folie aan de ene kant. Bereid 20 of meer barrières voor de operatie dag. Plaats de folie deksel op de schaal en bewaar de barrières op een plaats waar ze niet zullen worden verstoord. OPMERKING: Zelfs een lichte klop kan de barrières kantelen of zeggen dat ze vasthouden aan statische aan de zijkanten van het gerecht. Incubeer bevruchte kippeneieren op hun kant op karton eidienbladen bij 38 °C voor de juiste lengte van tijd voordat de werking de dag, zodanig dat de embryo's zal worden op het gewenste 8 podium. 2. Voorbereiding van de kippenembryo's en parels op Operation Day 'Window' bebroede kippeneieren. LET OP: De volgende methode voor het openen van eieren werd doorgegeven door Dennis Summerbell (niet gepubliceerd). Met het ei liggend op zijn kant, doorboren het stompe einde (luchtzak einde) van het ei met type AA sterke tang om ervoor te zorgen dat de binnenschil membraan is verbroken. Om dit te begrijpen de tang stevig tegen elkaar te doen en gebruik maken van een gecontroleerde stekende beweging terwijl het ei met de vrije hand. Neem het ei, nog steeds op zijn kant, in beide handen (één aan weerszijden) om 180 ° langs de horizontale as en plaats het in het ei lade zodat de zijde die bovenste was nu naast de lade. Let op: dit lost het embryo uit de schelp membranen en zal betekenen dat het embryo is less waarschijnlijk te snijden wanneer het reservoir boven het embryo wordt verwijderd. Neem een ​​stukje doorzichtige tape ongeveer 5 cm in het vierkant en plak dit nauwlettend in de bovenste oppervlak van het ei aan de eierschaal stoppen afbrokkelende op het embryo wanneer het ei wordt geopend. Gebruik de gebogen schaar om voorzichtig breken door de schaal en de membranen in het midden van het bovenste deel van het ei, maak een klein gaatje met een blad van de schaar zodat de lucht het ei via embryo (dat ligt net onder kan komen het bovenste deel van de shell). Opmerking: Door gewoon breken de schaal membranen en breken niet een van de membranen die het embryo, lucht die het ei zal het embryo van de mantel van de houder te scheiden en het embryo tot rust komen bovenop de dooier ongeveer 0,5-1 cm . Gebruik de gebogen schaar om het gat in de schaal uitbreiden met een cirkel met een diameter van ongeveer 1 cm. Verwijder het stukje uitgesneden shell en bedek het gat in het ei met eenstuk doorzichtige tape ongeveer 5 cm in het vierkant. Om deze band gemakkelijk verwijderen, drukt u op de tape om het te plakken alleen aan de rand van het gat, waardoor de resterende bandlengte gratis. De gratis tape kan dan worden aangegrepen om het ei te ontsluiten. Stage embryo Na incubatie bij 38 ° C (zie stap 1.7) en window (stap 2.1), gebruik maken van een binoculair microscoop om de kippenembryo's te organiseren op basis van 8. Doe dit net voor de eieren worden afgesloten volgende window. Schrijf het stadium van elk embryo over de eierschaal. Zet de eieren in de incubator. LET OP: embryo's in etappes tussen de 8 en 15 zijn geschikt voor barrière en kralen experimenten. De embryo's hebben meer kans om te overleven als ze niet uit de incubator gelaten te lang voorafgaand aan de operatie. Inweken kralen voorafgaand aan de operatie. FGF4 Neem het aantal affiniteitschromatografie gelparels (150-300 pm) die zich aan het uiteinde van een 1000 pi pipetpunt en wash ze in 1 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een microcentrifugebuis aan het azide ze in. Centrifuge bewaard 5 sec verwijderen, gooi de PBS en tweemaal het proces herhalen. Laat de gel parels in een 30 ul druppel van 0,35 mg / ml FGF4 eiwit op een steriele petrischaal op ijs gedurende 30 min. Extra kralen ongeveer 150 micrometer in diameter met No. 5 microforceps ingebracht in het embryo. OPMERKING: ga ionenuitwisselende harskorrels in de volgende stappen No. 5 microforceps en grip ze zeer voorzichtig omdat de kralen zijn bros en kan breken als te strak geperst. Deze waarschuwing geldt voor 2.3.2-2.3.3 en alle hars kraal operaties. RA Ontdooien een hoeveelheid van 0,05 of 0,1 mg / ml all-trans-RA verdund met DMSO en plaats een 100 ul druppel op een steriele petrischaal (9 cm diameter), die vooraf is bedekt met folie en de RA bescherming tegen licht. Neem een ​​10 ul pipet tip en pick-up enkele chloride-vorm ionenwisselingharskorrels op zijn achterkant en genieten die in de RA daling beschermd tegen licht bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Spoel de kralen in drie opeenvolgende druppels van 100 pl Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dat in dezelfde petrischaal minimaal 1 cm. LET OP: De kralen nemen van de fenol rode kleurstof uit de DMEM. Deze methode is gebaseerd op 5. Extra kralen ongeveer 100 micrometer in diameter (bolletjes variëren in grootte 75-180 gm wanneer nat) voor inbrenging in het embryo, microscopisch stadium graticule dia onder het petrischaaltje No.5 microforceps aan de korrels te houden. Bij het ophalen van de kraal van de 100 ul druppel van DMEM, in de eerste plaats de kraal naar beneden op de petrischaal en verwijder alle resterende DMEM van het ofwel door op de hiel uit de drop of door het plaatsen van de gesloten tang naast de kraal (capillaire actie trekt de vloeistof weg van de kraal). BMS 493 Als voor de RA (2.3.2), geniet ion exchange harskorrels in een 100 ul druppel van 2,5 of 5,0 mg / ml BMS 493 in DMSO bij kamertemperatuur gedurende 20 min spoel in 100 ul DMEM druppels. Extra kralen ongeveer 100 micrometer diameter voor inbrenging in het embryo. DMSO controle Wat de RA (2.3.2), geniet ionenuitwisselende harskorrels in een 100 ul druppel DMSO bij kamertemperatuur gedurende 20 min spoel in 100 ul DMEM druppels. Extra kralen ongeveer 100 micrometer diameter voor inbrenging in het embryo. 3. Barrier en Bead Operations Figuur 1. Schema van kippenembryo's van verschillende stadia zien waar Barrières en of kralen moet worden geplaatst. (A) Stage 13 kippenembryo schematische weergave barrière positie (groene lijn) tussen somieten en LPM aan het presumptieve wing-niveau (somieten 15-20). (B) Hetzelfde schema als in (A) te geven waarbij RA kraal (rode cirkel) voorafgaand aan insertie barrière worden geplaatst. (C) Schematische vertoning barrière positie (groene lijn) op de vermoedelijke been niveau (somieten 26-32) in een fase 15 embryo. (D) hetzelfde schema als in (C), aangegeven waar RA kraal (rode cirkel) worden ingeschreven. (E) Schematische aangegeven waar BMS 493 kralen (paars cirkels) in de LPM moet worden geplaatst van een podium 15 embryo. (F) Schematische weergave van een etappe 9 kippenembryo aangeeft barrière positie (groene lijn) tussen de presomitische mesoderm en LPM op de vermoedelijke vleugel niveau. (G) Schematische weergave van een etappe 9 embryo toont de posities van een barrière (groene lijn) en RA kraal (rode cirkel). (H) Schematische weergave van een etappe 10 kippenembryo tonen barrière positie (groene lijn) op de vermoedelijke been niveau. (I </strong>) Schematische weergave van BMS 493 kraal positie (paarse cirkel) in fase 10 been niveau LPM. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Barrier ingevoegd op stadium 13 tot vleugel bud initiatie te voorkomen. Neem een ​​podium 13 embryo uit de incubator en plaats het ei op een ei rust onder een binoculair microscoop ingesteld op 3,2X vergroting of hoger indien gewenst. Verwijder de bovenste laag doorzichtige tape. Met een stalen micro mes een insnijding door het vitelline membraan en laterale plaat mesoderm (LPM) nabij somieten 15 tot 20 (Figuur 1A) aan de rechterzijde van het embryo (somieten niet allemaal gevormd in dit stadium). Snijd grenzend aan de laatste vier somieten gevormd en blijven de snede twee somite lengtes caudaal. Pak de barrière (0,7-1 mm breed) met No. 5 microforceps eind uitsteekt uit het petrischaaltje draai de hand om het vrije einde van de barrière in de incisie te voegen. Het scharnier gevormde barrière vlak op de vitelline membraan boven de LPM met de helft van het naar beneden uitsteken door de incisie distaal van de somieten. Zo spoedig mogelijk verzegelen het ei met doorzichtige tape en terug naar de incubator. LET OP: De micro mes en een tang kleverig worden bij contact met de vitelline membraan. Het is belangrijk deze schoon met 70% ethanol te vegen voordat een volgende bewerking. Dit geldt voor alle latere werking beschrijvingen en implantaties kraal. Als een kraal is in combinatie met een barrière te voegen; Ten eerste neemt de kraal in No. 5 microforceps en plaats deze in het snijvlak van de LPM aan de distale zijde van de incisie en steek de barrière in de incisie proximale aan de korrel (Figuur 1B). Seal het ei en terug te snel naar de incubator. </li> Barrier ingevoegd op stadium 15 tot been bud initiatie te voorkomen. Opmerking: Een voorbeeld van het resultaat van deze operatie op Tbox 4 transcriptiefactor (Tbx4) expressie wordt weergegeven in figuur 2D en 2E. Neem een ​​podium 15 embryo uit de incubator en plaats het ei op een ei rust onder een binoculair microscoop ingesteld op 3,2X vergroting of hoger indien gewenst. Verwijder de bovenste laag doorzichtige tape. Uit stalen micro mes een insnijding door het vitelline membraan en LPM naast somieten 26-32 (figuur 1C) aan de rechterzijde van het embryo (somieten niet allemaal gevormd in dit stadium). Snijd grenzend aan de laatste twee somieten gevormd en blijven de cut vijf somite lengtes caudaal. Pak de barrière (1,2-1,3 mm) met No. 5 microforceps aan één einde en draai de belemmering van het vrije uiteinde in de incisie te voegen. Zo spoedig mogelijk verzegelen het ei met doorzichtige tape eennd terug naar de incubator. Opmerking: Het scharnier gevormde barrière vlak op de vitelline membraan boven de LPM met de helft van het naar beneden uitsteken door de incisie distaal van de somieten. Als een kraal is in combinatie met een barrière te voegen, ten eerste neemt de kraal No.5 microforceps en plaats deze in het snijvlak van de LPM aan de distale zijde van de incisie en steek de barrière in de incisie proximaal de kraal (figuur 1D). Seal het ei en terug te snel naar de incubator. Als een kraal of kralen zijn zonder een belemmering te worden ingebracht, bijvoorbeeld BMS 493 kralen om het been regio in de eerste fase 15, niet de lange incisie (3.2.2.1) te maken. Voeg een kleine incisie door de vitelline membraan en in de LPM ter plaatse van de hiel wordt geplaatst. Neem de kraal in No. 5 microforceps en plaats deze in het gat in de LPM. Duw het in een beetje verder met de gesloten uiteinden van de tang (figuur 1E). </li> Barrier ingevoegd op stadium 9 tot vleugel bud inductie en initiatie te voorkomen. Neem een ​​podium 8 of 9 embryo uit de incubator en plaats het ei op een ei rust onder een binoculair microscoop ingesteld op 3,2X vergroting of hoger indien gewenst. Uit stalen micro mes een insnijding door het vitelline membraan en LPM laterale en rostraal van de primitieve streep, aan het caudale einde van de embryo overeenkomstig de somieten (Figuur 1F) ongeveer 5 somite lengtes lang. Pak de barrière (0,7-1 mm breed) met No. 5 microforceps eind uitsteekt uit het petrischaaltje draai de hand om het vrije einde van de barrière in de incisie te voegen. Zo spoedig mogelijk verzegelen het ei met doorzichtige tape en terug naar de incubator. LET OP: Het scharnier gevormde barrière ligt plat op de vitelline membraan boven de LPM met de helft van het naar beneden uitsteekt door de incisie. Als een kraal inserte zijnd in combinatie met een barrière; Ten eerste neemt de kraal in No. 5 microforceps en plaats deze in het snijvlak van de LPM aan de distale zijde van de incisie en steek de barrière in de incisie proximale aan de korrel (figuur 1G). Seal het ei en terug te snel naar de incubator. Barrier ingevoegd op stadium 10 tot been bud inductie en initiatie te voorkomen. Opmerking: Een voorbeeld van het resultaat van deze operatie op Tbx4 expressie wordt getoond in figuur 2G. Neem een ​​podium 10 embryo uit de incubator en plaats het ei op een ei rust onder een binoculair microscoop ingesteld op 3,2X vergroting of hoger indien gewenst. Uit stalen micro mes een insnijding door het vitelline membraan en LPM lateraal van het primitieve streep, aan het caudale einde van de embryo overeenkomstig de somieten (figuur 1H) ongeveer 6 somiet lengtes lang. Pak de barrière (1.2mm breed) met No. 5 microforceps eind uitsteekt uit het petrischaaltje draai de hand plaats het vrije einde van de barrière in de incisie. Zo spoedig mogelijk verzegelen het ei met doorzichtige tape en terug naar de incubator. LET OP: Het scharnier gevormde barrière ligt plat op de vitelline membraan boven de LPM met de helft van het naar beneden uitsteekt door de incisie. Als een kraal is zonder belemmering te voegen, bijvoorbeeld BMS 493 kogeltje om de beengebied in stap 10, een kleine incisie door de vitelline membraan en in de LPM ter plaatse van de hiel wordt geplaatst. Neem de kraal in No. 5 microforceps en plaats deze in het gat in de LPM. Duw het in een beetje verder met de gesloten uiteinden van de tang (figuur 1I). 24 uur of langer na bedienen controleer de positie van de barrière ten opzichte van de opkomende contralaterale ledematen bud. Gooi embryo's waarbij de barrière is duidelijk niet opposite de linker ledematen kiem. In dit geval is de barrière ten onrechte is geplaatst. 4. Oogsten Embryo's, Fixatie en voorbereiding voor het Wholemount In Situ Hybridisatie (WISH) Oogsten embryo's na de operatie. Oogst embryo's in stadium 19-23 zodat ledemaatknop morfologie is duidelijk zichtbaar in zowel de geopereerde en contralaterale controle zijden. Met behulp van gebogen schaar knippen een groter gat in de eierschaal. Snijd rond het embryo terwijl de grote bloedvaten links van de embryo met microforceps. Gebruik deze greep van het vaartuig naar het embryo te verwijderen en plaats deze in een petrischaal van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,3. Onder een binoculaire microscoop, ontleden weg extra embryonale schepen en membranen met een combinatie van gebogen schaar en geen. 5 microforceps. Verwijder het hoofd met behulp van een schaar. Fixatie van embryo's te plaatsen oogsten. Met behulp van gebogen Blunt tang, til de embryo en het in 5 ml 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS bij kamertemperatuur gedurende twee uur schommelen en vervolgens bij 4 ° C geïncubeerd in een 20 ml glazen fles met een schroefdop. Let op: PFA is een ernstig gevaar voor de gezondheid. Het is een schadelijk, bijtend irriterend en het poeder moet worden voorkomen dat in contact komt met de huid, ogen en longen. Gebruik persoonlijke beschermende kleding en een afzuigkap tijdens het bereiden van de oplossing. Zodra het is een oplossing van 4%, handschoenen, oogbescherming en een laboratoriumjas verplicht. LET OP: Het is belangrijk om de embryo's in fix snel om de beste te bewaren mRNA integriteit. Verwijderen van obstakels vóór wholemount in situ hybridisatie. LET OP: Barrières worden verwijderd, omdat ze zijn scherp en kunnen embryo's beschadigen als ze gaan door middel van de in situ hybridisatie protocol, vooral als meerdere embryo's worden gekleurd in een keer. Na fixatie, plaats het embryo in een schotel van PBS onder een binoculair microscope. Gebruik van twee paar No. 5 microforceps Plaats de linker paar nauw weerszijden van de barrière in de geopereerde zijde van het embryo. Pak de slagboom met de juiste pair en trek de barrière van het embryo met de linker pair naar het embryo te houden en om weefsel te voorkomen dat het naleven van de barrière als het wordt verwijderd. Verricht WISH in hoofdzaak zoals beschreven in 11.