L'applicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick

Il seguente protocollo utilizza embrioni di pollo in meno di dieci giorni di incubazione. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con King College di Londra, Regno Unito e le linee guida per la cura degli animali nel Regno Unito Ministero degli Interni. 1. Preparazione necessaria prima di embrione di pollo Operation Raccogliere i seguenti strumenti chirurgici necessari per le operazioni, per la raccolta e per fissare gli embrioni di pollo: due coppie di n ° 5 orologiai pinze, una coppia di pinze forti, ad esempio, di tipo AA, forbici curve con lame lunghe 2,5 cm, smussato conclusa curvo pinze con estremità lunghe circa 0,5 cm, e anche due coppie di n ° 4 orologiai pinze da usare rendendo barriere lamina (1.6.3). Fare un micro coltello da un perno in acciaio (0,3 mm di diametro) affilata con olio su una pietra affilatura. Utilizzando un microscopio binoculare, affilare la punta del perno ad una lama piatta. Posizionare il perno in un supporto ago e proteggere la sua estremità appuntita e da urti e denTed. NOTA: Rinfoderando il coltello con la punta della pipetta 1000 microlitri è una semplice opzione per questo. Preparare 70% di etanolo in una bottiglia di lavaggio di plastica. Utilizzare uno spruzzo di questo su un fazzoletto di carta per pulire gli strumenti chirurgici e la micro coltello prima e dopo l'uso per sterilizzare e pulirli. Acquista 5 cm di larghezza nastro adesivo trasparente e un dispenser adatto. Trova o fabbricare un riposo adeguato per tenere un uovo di gallina stabile su un fianco. Marca e soluzioni magazzini, perle da bagno. Preparare una soluzione di 0,35 mg / ml di proteine ​​dei fibroblasti Growth Factor 4 (FGF4) da 1 mg / ml Stock Frozen diluendo con acqua e conservare a -20 ° C in 30 microlitri aliquote. Preparare soluzioni (sia 0,05 o 0,1 mg / ml) di tutto-trans retinoico (RA) diluito con dimetilsolfossido (DMSO) in provette da microcentrifuga scuri da un / magazzino 5 mg ml. Conservare il magazzino e aliquote di 100 microlitri a -20 ° C. Preparare soluzioni (sia 2,5 o 5 mg / ml) di BMS 493 (a ag inversaonist di RARs) diluito con DMSO in tubi microcentrifuga scuri da un / magazzino 10 mg ml. Conservare il magazzino e aliquote di 100 microlitri a -20 ° C. Fare barriere da un foglio di alluminio. NOTA: La pellicola usata per fare le barriere è un foglio di ristorazione standard (misurata dal micrometro come spessore 0,013 mm). Ogni foglio di alluminio domestico sarebbe probabilmente adatto. Tagliare un 1 centimetro quadrato di carta stagnola e sterilizzare lo strofinandola con etanolo al 70% su un tessuto. Posizionarlo su un 6 centimetri di plastica sterile Petri. Eliminare il coperchio e fare un coperchio per il piatto di stagnola. NOTA: Questo consentirà di evitare le barriere di taglio da poi attaccare il coperchio di plastica del piatto a causa di statica. Porre la capsula di Petri in cima ad un reticolo stadio (1 cm di lunghezza diviso in 100 sezioni) sotto un microscopio binoculare con ingrandimento impostato 1.6X. Utilizzando una lama No.15 piccolo bisturi, tagliare le strisce di lamina per una larghezza esatta, ad esempio 0,7 mm o 1,3 mm. Separare la pellicolastrisce con due coppie di n ° 4 orologiai pinze. Poi fare una curva ad angolo retto nel centro della barriera lamina tale che assomiglia una cerniera della larghezza specifica. NOTA: Questa forma di barriera è tratto da 9, 10. Una barriera a cerniera rimane in posizione migliore di una barriera di dritta, piatta. N ° 4 pinze sono relativamente smussato e sono usati perché sono meno propensi a fare ammaccature o punteggi nelle barriere stagnola. Linea le barriere nel centro del piatto Petri con un lato piatto contro il piatto e l'altra rivolta verso l'alto fuori del piatto, spostando il foglio uncut restante da un lato. Preparare 20 o più barriere prima del giorno di funzionamento. Mettere il coperchio stagnola sopra il piatto e memorizzare le barriere in un luogo dove non sarà disturbato. NOTA: Anche un lieve colpo può ribaltare le barriere più o significare che si attaccano con statico ai lati del piatto. Incubare uova di gallina fecondate dai loro lati su vassoi di cartone uovo a 38 °C per la durata di tempo appropriato prima giornata funzionamento, tali che gli embrioni sarà al desiderato 8 fase. 2. Preparazione di Chick embrioni e perline su Operazione Giorno 'Finestra' incubate uova di gallina. NOTA: Il seguente metodo per l'apertura delle uova è stata trasmessa da Dennis Summerbell (non pubblicata). Con l'uovo sdraiato su un fianco, forare l'estremità smussata (fine sacco aereo) del l'uovo con una pinza tipo AA forti facendo in modo che la membrana guscio interno è stato rotto. Per fare questo afferrare il forcipe saldamente insieme e utilizzare un movimento accoltellato controllato mentre si tiene l'uovo con la mano libera. Prendere l'uovo, ancora sdraiato su un lato, in entrambe le mani (una per ogni lato) ruotate di 180 ° lungo l'asse orizzontale e sostituirla nel vassoio di uovo in modo tale che il lato che era superiore è ora accanto al vassoio. NOTA: Questo allenta l'embrione dalle membrane guscio e vorrà dire che l'embrione è Less probabilità di essere tagliato quando il guscio sopra l'embrione viene rimosso. Prendete un pezzo di nastro adesivo trasparente circa 5 cm quadrati e bastone da vicino questo sulla superficie superiore dell'uovo di fermare il guscio dal fatiscente sul dell'embrione quando l'uovo si apre. Utilizzare le forbici curve per rompere dolcemente attraverso il guscio e le sue membrane nel centro della parte superiore dell'uovo, fare un piccolo foro con una lama delle forbici in modo che l'aria possa entrare nella uova su dell'embrione (che si trova appena sotto la parte superiore del guscio). NOTA: basta rompere le membrane del guscio e non rompere qualsiasi delle membrane che coprono l'embrione, aria che penetra l'uovo separerà l'embrione dal guscio e l'embrione verrà a riposo in cima al tuorlo circa 0,5-1 cm dalla shell . Utilizzare le forbici curve per allargare il foro nel guscio di un cerchio con un diametro di circa 1 cm. Rimuovere il pezzo di guscio di asportato e coprire il buco nel uovo con unpezzo di nastro adesivo trasparente circa 5 cm quadrati. Per rimuovere facilmente questo nastro, premere il nastro per attaccarlo solo al bordo del foro, lasciando il nastro rimane libero. Il nastro libero può quindi essere afferrato per unseal l'uovo. embrioni fase Dopo l'incubazione a 38 ° C (vedi punto 1.7) e finestre (passo 2.1), utilizzare un microscopio binoculare per mettere in scena gli embrioni pulcino in base alle 8. Fate questo appena prima che le uova sono sigillati in seguito a finestre. Scrivi la fase di ogni embrione sul guscio d'uovo. Riportare le uova per l'incubatore. NOTA: embrioni a tappe tra 8 e 15 sono adatti per esperimenti barriera e perline. Gli embrioni sono più probabilità di sopravvivere se non sono stati lasciati fuori dell'incubatore troppo a lungo prima del funzionamento. perline ammollo prima del funzionamento. FGF4 Prendere il numero di perline gel affinità cromatografia (150-300 micron) che si attaccano alla fine di un puntale di 1000 ml ed è statoli h in 1 ml di tampone fosfato salino (PBS) in una provetta per rimuovere il azide sono memorizzati in. Centrifugare per 5 secondi, scartare il PBS e ripetere il processo per due volte. Impregnano le perline gel in una goccia 30 ml di 0,35 mg / ml di proteine ​​FGF4 su una piastra di Petri sterile in ghiaccio per 30 min. Raccogliere perle di circa 150 micron di diametro con n ° 5 microforceps per l'inserimento in un embrione. NOTA: Maneggiare ioni di perle in resina di cambio utilizzato per le seguenti operazioni con n ° 5 microforceps e li presa molto delicatamente, perché le perle sono fragili e possono rompersi se spremuto troppo stretto. Questa avvertenza vale per 2.3.2-2.3.3 e tutte le operazioni di perline di resina. RA Scongelare una aliquota di 0,05 o 0,1 mg / ml all-trans-RA diluito con DMSO e una goccia 100 microlitri su una piastra di Petri sterile (9 cm di diametro), che è stato precedentemente rivestito in stagnola per proteggere il RA dalla luce. Prendere una punta della pipetta 10 microlitri e raccogliere qualche scambio sotto forma di ione cloruroperle di resina sulla sua estremità e impregnano questi nella goccia RA riparo dalla luce a temperatura ambiente per 20 min. Lavare le perline in tre gocce successive di 100 ml di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) posti sulla stessa piastra Petri di almeno 1 cm di distanza. NOTA: Le perle occupano il colorante rosso fenolo dalla DMEM. Questo metodo si basa su 5. Raccogliere perle di circa 100 micron di diametro (perline variano nel formato 75-180 micron quando è bagnato) per l'inserimento in un embrione, utilizzando un vetrino reticolo fase di microscopio sotto le Petri piatto e No.5 microforceps per tenere le perline. Quando si solleva il tallone dal menu a 100 ml di DMEM, il primo posto il tallone verso il basso sulla piastra di Petri e rimuovere eventuali residui di DMEM da esso sia spingendo il tallone fuori dalla caduta o mettendo le pinze chiuse accanto al tallone (capillare azione trae il liquido dal tallone). BMS 493 Per quanto riguarda la RA (2.3.2), immergere exch ioniperle di resina ange in una goccia 100 ml di 2,5 o 5,0 mg / ml BMS 493 in DMSO a temperatura ambiente per 20 minuti quindi risciacquare in 100 gocce microlitri di DMEM. Raccogliere perle di circa 100 micron di diametro per l'inserimento nell'embrione. controllo DMSO Come per il RA (2.3.2), immergere perle di resina a scambio ionico in una goccia 100 ml di DMSO a temperatura ambiente per 20 minuti quindi risciacquare in 100 gocce microlitri di DMEM. Raccogliere perle di circa 100 micron di diametro per l'inserimento nell'embrione. 3. Le operazioni barriera e Perle Figura 1. Schema di Chick embrioni di varie fasi che mostra dove le barriere e le perline o deve essere collocato. (A) Fase 13 embrionali di pollo posizione che mostra schema barriera (linea verde) tra i metameri e LPM presso la presunzionelivello dell'ala tivo (somiti 15-20). (B) Lo stesso schema come in (A), che indica dove branello RA (cerchio rosso) deve essere collocato prima dell'inserimento barriera. (C) posizione schematiche barriera (linea verde) a livello della gamba presuntiva (somiti 26-32) in una fase embrionale 15. (D) Lo stesso schema come in (C), che indica dove dovrebbe essere collocato un branello RA (cerchio rosso). (E) Schema che indica dove BMS 493 perline (cerchi viola) devono essere collocati nel LPM di una fase embrionale 15. (F) Schema di uno stadio 9 embrione di pollo che indica la posizione di barriera (linea verde) tra il mesoderma presomitic e LPM a livello dell'ala presuntiva. (G) Schema di uno stadio embrionale 9 che mostra le posizioni di una barriera (linea verde) e RA tallone (cerchio rosso). (H) Schema di uno stadio 10 embrionali di pollo che mostra la posizione di barriera (linea verde) a livello della gamba presuntiva. (I </strong>) Schema che mostra BMS 493 posizione tallone (cerchio viola) in fase di 10 livello della gamba LPM. Questa cifra è stata modificata da 7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Barriera inserita in fase 13 per prevenire l'iniziazione ala nascere. Prendere una fase embrionale 13 dal termostato e mettere l'uovo in un uovo di riposo sotto un microscopio binoculare impostato l'ingrandimento 3,2X o superiore se si preferisce. Rimuovere lo strato superiore del nastro adesivo trasparente. Utilizzando una micro coltello in acciaio, fare una incisione attraverso la membrana vitellina e la piastra laterale mesoderma (LPM) adiacente a somiti 15 a 20 (Figura 1A) sul lato destro dell'embrione (somiti non hanno tutte formate in questa fase). Tagliare adiacente agli ultimi quattro somiti formate e continuare il taglio di due lunghezze somite caudale. Raccogliete la barriera (larghezza 0,7-1 mm) con n ° 5 microforceps all'estremità sporgente dalla piastra di Petri e ruotare la mano per inserire l'estremità libera della barriera nell'incisione. La barriera a forma di cerniera adagiata sulla membrana vitellina di sopra del LPM con la metà di esso che sporge verso il basso attraverso il distale incisione per i somiti. Non appena possibile sigillare l'uovo con nastro adesivo trasparente e restituirlo al incubatrice. NOTA: Il micro coltello e pinze diventare appiccicoso a contatto con la membrana vitellina. È importante pulirli con etanolo al 70% prima di un'operazione successiva. Questo vale per tutte le successive descrizioni di funzionamento e da bordare implantologia. Se un cordone deve essere inserito in combinazione con una barriera; in primo luogo, prendere il tallone in No. 5 microforceps ed inserirla nella faccia taglio del LPM sul lato distale dell'incisione e quindi inserire la barriera nella prossimale incisione per il tallone (Figura 1B). Sigillare l'uovo e restituirlo prontamente al incubatore. </li> Barriera inserita in fase 15 a prevenire l'innesco gemma gamba. NOTA: Un esempio del risultato di tale operazione sul Tbox 4 fattore di trascrizione (Tbx4) espressione è mostrato nella Figura 2D e 2E. Prendere un embrione fase 15 dal termostato e mettere l'uovo in un uovo di riposo sotto un microscopio binoculare impostato l'ingrandimento 3,2X o superiore se si preferisce. Rimuovere lo strato superiore del nastro adesivo trasparente. Usando un coltello in acciaio micro fare una incisione attraverso la membrana vitellina e LPM adiacente somiti 26 a 32 (Figura 1C) sul lato destro dell'embrione (somiti non hanno tutte formate in questa fase). Tagliare adiacente alle ultime due somiti formate e continuare i taglio di cinque lunghezze somite caudale. Sollevare la barriera (larghezza 1,2-1,3 mm) con No. 5 microforceps ad una estremità e ruotare la barriera di inserire l'estremità libera nel dell'incisione. Non appena possibile sigillare l'uovo con un nastro adesivo trasparenteND restituirlo al incubatrice. NOTA: La cerniera barriera a forma adagiata sulla membrana vitellina di sopra del LPM con la metà di esso che sporge verso il basso attraverso il distale incisione per i somiti. Se un cordone deve essere inserito in combinazione con una barriera, in primo luogo, prendere il tallone in No. 5 microforceps ed inserirla nella faccia taglio del LPM sul lato distale dell'incisione e quindi inserire la barriera nella prossimale incisione per il tallone (Figura 1D). Sigillare l'uovo e restituirlo prontamente al incubatore. Se una perlina o perle sono da inserire, senza una barriera, ad esempio, BMS 493 perline per la regione gamba in fase di 15, non fanno la lunga incisione (3.2.2.1). Fai una piccola incisione attraverso la membrana vitellina e nel LPM nella posizione il tallone deve essere collocato. Prendere il tallone in n ° 5 microforceps e inserirlo nel foro nel LPM. Spingere in un po 'più con le estremità chiuse della pinza (Figura 1E). </li> Barriera inserita in fase 9 per evitare che un'ala di induzione gemma e l'iniziazione. Prendere una fase 8 o 9 embrione dal termostato e mettere l'uovo in un uovo di riposo sotto un microscopio binoculare impostato l'ingrandimento 3,2X o superiore, se si preferisce. Usando un coltello in acciaio micro fare un'incisione attraverso la membrana vitellina e LPM laterale e rostrale della stria primitiva, alla fine caudale dell'embrione in linea con le somiti (Figura 1F) circa 5 somite lunghezza lungo. Sollevare la barriera (larghezza 0,7-1 mm) con No. 5 microforceps all'estremità sporgente dalla piastra di Petri e ruotare la mano per inserire l'estremità libera della barriera nell'incisione. Non appena possibile sigillare l'uovo con nastro adesivo trasparente e restituirlo al incubatrice. NOTA: La cerniera barriera a forma adagiata sulla membrana vitellina sopra il LPM con la metà di esso sporge verso il basso attraverso l'incisione. Se un tallone è di essere inserted in combinazione con una barriera; in primo luogo, prendere il tallone in No. 5 microforceps ed inserirla nella faccia taglio del LPM sul lato distale dell'incisione e quindi inserire la barriera nella prossimale incisione per il tallone (Figura 1G). Sigillare l'uovo e restituirlo prontamente al incubatore. Barriera inserita in fase di 10 per evitare l'induzione gemma gamba e iniziazione. NOTA: Un esempio del risultato di questa operazione sull'espressione Tbx4 è mostrato in Figura 2G. Prendere un embrione fase 10 dal termostato e mettere l'uovo in un uovo di riposo sotto un microscopio binoculare impostato l'ingrandimento 3,2X o superiore se si preferisce. Usando un coltello in acciaio micro fare una incisione attraverso la membrana vitellina e LPM lateralmente alla linea primitiva, alla fine caudale dell'embrione in linea con somiti (Figura 1H) circa 6 somite lunghezze grande. Raccogliete la barriera (1.2mm di larghezza) con No. 5 microforceps all'estremità sporgente dalla piastra di Petri e ruotare la mano per inserire l'estremità libera della barriera nell'incisione. Non appena possibile sigillare l'uovo con nastro adesivo trasparente e restituirlo al incubatrice. NOTA: La cerniera barriera a forma adagiata sulla membrana vitellina sopra il LPM con la metà di esso sporge verso il basso attraverso l'incisione. Se un cordone deve essere inserito senza barriera, ad esempio, BMS 493 tallone alla zona della gamba nella fase 10, fare una piccola incisione attraverso la membrana vitellina e nel LPM nella posizione il tallone deve essere collocato. Prendere il tallone in n ° 5 microforceps e inserirlo nel foro nel LPM. Spingere in un po 'più con le estremità chiuse della pinza (Figura 1 decies). 24 ore o più dopo che operano controllare la posizione della barriera rispetto al germoglio arto controlaterale emergente. Eliminare eventuali embrioni in cui la barriera non è chiaramente opposite la gemma arto sinistro. In questo caso la barriera è stata erroneamente posizionato. 4. La raccolta embrioni, Fissazione e preparazione per Wholemount ibridazione in situ (WISH) embrioni raccolta inviare operazione. embrioni Harvest allo stadio 19-23 in modo tale che arto gemma morfologia è chiaramente visibile in entrambi i lati di controllo gestite e controlaterale. Con le forbici curve tagliare un foro più grande nel guscio d'uovo. Tagliare tutto l'embrione tenendo il vaso sanguigno grande da sinistra dell'embrione con microforceps. Utilizzare questa presa della nave per rimuovere l'embrione e metterlo in una capsula di Petri di tampone fosfato salino (PBS) pH 7,3. Sotto un microscopio binoculare, sezionare vasi embrionali supplementari e membrane utilizzando una combinazione di forbici curve e non. 5 microforceps. Togliere la testa con le forbici. Fissazione di embrioni post-raccolta. Utilizzando blun curvot pinze, sollevare l'embrione e collocarlo in 5 ml 4% paraformaldeide (PFA) in PBS a temperatura ambiente per due ore e poi dondolo a 4 ° C durante la notte in una bottiglia di vetro da 20 ml con tappo a vite. Attenzione: PFA è un serio pericolo per la salute. Si tratta di un nocivo, irritante corrosivo e la polvere deve essere impedito di venire a contatto con la pelle, occhi e polmoni. Utilizzare indumenti protettivi personali e una cappa aspirante durante la preparazione della soluzione. Una volta che si tratta di una soluzione al 4%, guanti, occhiali di protezione e un camice da laboratorio devono essere indossati. NOTA: E 'importante per ottenere gli embrioni in fix velocemente per meglio preservare l'integrità mRNA. La rimozione delle barriere prima di wholemount in ibridazione in situ. NOTA: Le barriere vengono rimossi perché sono taglienti e possono danneggiare gli embrioni come vanno attraverso il protocollo in situ, soprattutto se diversi embrioni sono macchiati in una sola volta. A seguito di fissaggio, posizionare l'embrione in un piatto di PBS in un mi binocolocroscope. Utilizzando due coppie di No. 5 microforceps, posizionare la coppia sinistra strettamente lati della barriera nel lato operato dell'embrione. Afferrare la barriera con la coppia di destra e tirare delicatamente la barriera dall'embrione utilizzando la coppia di sinistra per mantenere l'embrione giù e per evitare qualsiasi tessuto aderisca allo sbarramento come viene rimosso. Effettuare WISH essenzialmente come descritto in 11.