Aplicação de barreiras impermeáveis ​​combinadas com Candidate Fator Beads Soaked para estudar sinais indutores do pintainho

O protocolo seguinte utiliza embriões de galinha em menos de dez dias de incubação. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com a Faculdade Londres do rei, Reino Unido e as orientações de cuidados de animais UK Home Office. 1. Preparação necessária antes em Chick Embryo Operação Reúna os seguintes instrumentos cirúrgicos necessários para as operações, para a colheita e para a fixação dos embriões de galinha: Dois pares de No. 5 relojoeiros fórceps, um par de fórceps fortes, por exemplo, do tipo AA, tesouras curvas com lâminas de 2,5 cm de comprimento, sem corte terminou curvado pinças com extremidades aproximadamente 0,5 cm de comprimento, e também dois pares de No. 4 relojoeiros pinça para usar ao fazer barreiras folha (1.6.3). Faça um micro faca de um pino de aço (0,3 mm de diâmetro) afiada usando o óleo em uma pedra de amolar. Utilizando um microscópio binocular, afiar a ponta do pino de uma lâmina plana. Coloque o pino em um suporte de agulha e proteger a sua ponta afiada de ser batido e dented. NOTA: Os invólucros a faca com uma ponta de 1.000 mL pipeta é uma opção simples para isso. Preparar etanol a 70% em um frasco de lavagem de plástico. Use um esguicho de presente em um lenço de papel para limpar os instrumentos cirúrgicos e do micro faca antes e após o uso para esterilizar e limpá-los. Compre 5 cm de largura fita adesiva clara e um distribuidor adequado. Localizar ou fabricar um descanso adequado para manter um ovo de galinha constante em seu lado. Fazer e soluções de loja para contas de imersão. Prepara-se uma solução de 0,35 mg / ml de proteína (FGF4) Crescimento de Fibroblastos Factor de 4 a partir de 1 mg de estoque congelada / ml diluindo-a com água e armazenar a -20 ° C em alíquotas de 30 ul. Preparar as soluções (ou 0,05 ou 0,1 mg / ml) de todo-trans-retinóico (RA) diluiu-se com sulfóxido de dimetilo (DMSO) em tubos de microcentrífuga escuras de um estoque a 5 mg / ml. Armazenar o estoque e 100 mL alíquotas a -20 ° C. Preparar as soluções (ou 2,5 ou 5 mg / ml) de BMS 493 (um AG inversaonist dos RAR) diluída com DMSO em tubos de microcentrífuga escuras a partir de um 10 mg estoque / ml. Armazenar o estoque e 100 mL alíquotas a -20 ° C. Faça barreiras de folha de alumínio. NOTA: A folha usado para fazer as barreiras é a folha de restauração padrão (medida pelo micrómetro de 0,013 mm de espessura). Qualquer folha de alumínio doméstica provavelmente seria adequado. Cortar um pedaço quadrado de 1 cm de folha de alumínio e esterilizá-lo, limpando-o com 70% de etanol em um tecido. Coloque-o em um 6 centímetros de plástico estéril placa de Petri. Descartar a tampa e fazer uma tampa para o prato de folha. NOTA: Isto irá prevenir as barreiras de corte da tarde degola para a tampa de plástico do prato devido à estática. Colocar a placa de Petri por cima de uma retícula fase (1 cm de comprimento dividido em secções 100) sob um microscópio binocular com ampliação definida como 1,6X. Usando uma pequena lâmina de bisturi No.15, cortar tiras da folha a uma largura exata, por exemplo, 0,7 mm ou 1,3 mm. Separe a folhatiras usando dois pares de No. 4 relojoeiros fórceps. Em seguida, fazer uma curva em ângulo recto no centro da folha de barreira de tal modo que se assemelha a uma dobradiça da largura específica. NOTA: Esta forma de barreira é feita a partir de 9, 10. Uma barreira articulada permanece no lugar melhor do que uma barreira em linha reta, plana. No. 4 pinças são relativamente brusco e são usados ​​porque eles são menos propensos a fazer mossas ou pontuações nas barreiras de alumínio. Line up as barreiras no centro da placa de Petri com um lado plano contra o prato eo outro apontando para cima para fora do prato, movendo a folha sem cortes restantes para um lado. Prepare 20 ou mais barreiras antes do dia de operação. Coloque a tampa da folha sobre o prato e armazenar os obstáculos em um lugar onde não será perturbado. NOTA: Mesmo uma leve batida pode derrubar as barreiras mais ou significa que eles ficar com estática para os lados do prato. Incubar ovos de galinha fertilizados em seus lados em bandejas de ovos de papelão em 38 °C durante o período de tempo apropriado antes do dia da operação de tal modo que os embriões será desejado na fase 8. 2. Preparação de pintainho de embriões e grânulos em Operação Dia 'Janela' incubados ovos de galinha. NOTA: O método a seguir para a abertura de ovos foi transmitida por Dennis Summerbell (não publicado). Com o ovo deitado de lado, perfurar o fim brusco (ar final sac) do ovo com tipo AA forceps fortes certificando-se que a membrana interna da casca foi quebrado. Para fazer isso aperto da pinça com firmeza e use um movimento esfaqueamento controlada, mantendo o ovo com a mão livre. Leve o ovo, ainda deitado de lado, com ambas as mãos (um de cada lado) transformá-lo em 180 ° no eixo horizontal e substituí-lo na bandeja do ovo de tal forma que o lado que era mais elevada está agora ao lado da bandeja. NOTA: Este solta o embrião das membranas da casca e significará que o embrião é leSS susceptível de ser cortada quando o reservatório acima do embrião é removido. Pegue um pedaço de fita adesiva transparente aproximadamente 5 cm quadrado e cole isto de perto sobre a superfície superior do ovo para parar a casca de ovo de ruir sobre o embrião quando o ovo é aberto. Use as tesouras curvadas para quebrar suavemente através do invólucro e as suas membranas no centro da parte superior do ovo, fazer um pequeno orifício com uma lâmina da tesoura de modo que o ar possa entrar no ovo sobre o embrião (que se encontra apenas sob a parte superior do escudo). Nota: por apenas quebrar as membranas da casca e não quebrar qualquer das membranas que cobrem o embrião, o ar de entrar no ovo vai separar o embrião a partir da casca e o embrião virá a restante no topo da gema de cerca de 0,5-1 cm do escudo . Use a tesoura curva para aumentar o buraco na casca de um círculo com um diâmetro de aproximadamente 1 cm. Remover a peça de concha excisada e cobrir o buraco no ovo com umpedaço de fita adesiva transparente aproximadamente 5 cm quadrado. Para remover facilmente esta fita, pressione a fita para colocá-lo apenas na borda do buraco, deixando o restante da fita livre. A fita livre pode então ser apreendido, para abrir o ovo. embriões em estágio Após incubação a 38 ° C (ver passo 1.7) e de janelas (passo 2.1), utilizar um microscópio binocular para encenar os embriões de pinto de acordo com a 8. Faça isso logo antes que os ovos são selados na sequência de janelas. Faça o estágio de cada embrião na casca de ovo. Devolver os ovos para a incubadora. NOTA: Os embriões em estágios entre 8 e 15 são adequados para barreira e talão experimentos. Os embriões são mais propensos a sobreviver se eles não foram deixados de fora da incubadora por muito tempo antes da operação. grânulos de imersão antes da operação. FGF4 Aqui o número de contas de gel de cromatografia de afinidade (150-300 pM) que ficar com a extremidade de uma ponta de pipeta de 1000 mL e estavah-los em 1 ml de tampão fosfato salino (PBS) num tubo de microcentrífuga para remover a azida eles são armazenados em. Centrifugar durante 5 seg, descartar o PBS e repetir o processo duas vezes. Embeber os grânulos de gel numa queda de 30 uL de 0,35 mg / ml de proteína FGF4 numa placa de Petri estéril em gelo durante 30 min. Escolha os grânulos de aproximadamente 150 um de diâmetro com No. 5 micropinças para inserção no embrião. NOTA: Manipular esferas de resina de troca iônica usado nas etapas a seguir com o n.º 5 micropinças e pega-los com muito cuidado, porque as contas são frágeis e podem quebrar se apertou com muita força. Este aviso aplica-se a 2.3.2-2.3.3 e todas as operações de resina talão. RA Descongelar uma alíquota de 0,05 ou 0,1 mg / ml de all-trans-RA diluída com DMSO e colocar uma gota 100 ul numa placa de Petri estéril (9 cm de diâmetro), que foi previamente coberto de folha para proteger a RA da luz. Tome uma ponta de pipeta 10 ul e pegar alguma troca forma de ião cloretopérolas de resina na sua extremidade e mergulhar estes no gota RA protegida da luz à temperatura ambiente durante 20 min. Lavar as pérolas em três gotas sucessivas de 100 ul de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) colocados na mesma placa de Petri, pelo menos, 1 cm de distância. NOTA: Os grânulos de absorver o corante vermelho de fenol a partir do meio DMEM. Este método baseia-se em 5. Escolha os grânulos de aproximadamente 100 um de diâmetro (grânulos variam em tamanho de 75-180 uM quando molhado) para inserção dentro do embrião, usando uma retícula corrediça platina do microscópio sob a placa de Petri e No.5 micropinças para manter os grânulos. Ao escolher-se o cordão a partir da queda de 100 ul de DMEM, em primeiro lugar o talão para baixo para a placa de Petri e remover qualquer DMEM remanescente a partir dele, quer pressionando o rebordo para fora da gota ou colocando a pinça fechada ao lado do cordão (capilar acção chama o líquido para fora do grânulo). BMS 493 Quanto ao RA (2.3.2), mergulhe permuta de iõespérolas de resina em um ange gota 100 ul de 2,5 ou 5,0 mg / ml de BMS 493 em DMSO a temperatura ambiente durante 20 min e depois enxaguar em 100 ul de DMEM gotas. Escolha os grânulos de aproximadamente 100 um de diâmetro para inserção no embrião. controle de DMSO Como para a RA (2.3.2), embeber os grânulos de resina de permuta iónica numa gota de 100 ul de DMSO à temperatura ambiente durante 20 min e depois enxaguar em 100 ul de DMEM gotas. Escolha os grânulos de aproximadamente 100 um de diâmetro para inserção no embrião. 3. As operações de barreira e Bead Figura 1. Esquema de Chick embriões de várias fases mostrando onde Barreiras e ou grânulos deve ser colocado. (A) Stage 13 embrião de galinha posição exibição esquemática de barreira (linha verde) entre somites e LPM na presunçãonível da asa tiva (somitos 15-20). (B) O mesmo esquema como em (A), indicando onde RA talão (círculo vermelho) deve ser colocada antes da inserção barreira. (C) posição esquemático mostrando barreira (linha verde) ao nível da perna presuntivo (somites 26-32) em um estágio de 15 embriões. (D) O mesmo esquema como em (C), que indica quando um talão RA (círculo vermelho) deve ser colocado. (E) esquemático indicando onde BMS 493 esferas (círculos roxos) deve ser colocado na LPM de uma fase 15 de embrião. (F) Diagrama esquemático de um embrião de galinha estágio 9 que indica a posição de barreira (linha verde) entre a mesoderme presomitic e LPM ao nível da asa presuntivo. (G) Diagrama esquemático de um embrião em fase 9, que mostra as posições de uma barreira (linha verde) e talão RA (círculo vermelho). (H) Diagrama esquemático de um embrião de galinha fase 10 que mostra a posição de barreira (linha verde) ao nível da perna presuntivo. (I </strong>) Diagrama esquemático mostrando BMS 493 posição de talão (círculo roxo) no estádio 10 de nível perna LPM. Este valor foi modificado a partir de 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Barreira inserido na fase de 13 para evitar asa de iniciação bud. Tomar um embrião em fase 13 da incubadora e colocar o ovo num ovo restante sob um microscópio binocular magnificação definido para 3,2 vezes ou superior, se preferido. Remover a camada superior da fita adesiva transparente. Utilizando um aço micro faca, fazer uma incisão através da membrana vitelina e lateral placa mesoderme (LPM) adjacente à somitos de 15 a 20 (Figura 1A) no lado direito do embrião (somitos não têm todos formados nesta fase). Corte ao lado dos últimos quatro somites formados e continuar o corte dois comprimentos somite caudal. Pegar a barreira (0,7-1 mm de largura) com No. 5 microforceps no final saliente da placa de Petri e torcer a mão para inserir a extremidade livre da barreira dentro da incisão. A barreira em forma de dobradiça fica plana sobre a membrana vitelina acima da LPM com metade dela salientes para baixo através do distal incisão para somitos. O mais rapidamente possível selar o ovo com fita adesiva transparente e devolvê-lo para a incubadora. NOTA: O micro faca e pinças se tornar pegajosa em contato com a membrana vitelina. É importante limpe-os com etanol 70% antes de tentar uma operação subsequente. Isso se aplica a todas as descrições de operação subsequentes e a talão implantes. Se um grânulo é para ser inserido, em conjunto com uma barreira; em primeiro lugar, tomar o talão em No. 5 micropinças e inseri-lo no rosto cortado da LPM no lado distal da incisão e, em seguida, insira a barreira para o proximal incisão ao cordão (Figura 1B). Selar o ovo e devolvê-lo imediatamente para a incubadora. </li> Barreira inserido na fase 15 para prevenir a iniciação broto perna. NOTA: Um exemplo do resultado desta operação na expressão do factor de transcrição Tbox 4 (Tbx4) é mostrado na Figura 2D e 2E. Aqui uma fase 15 de embrião da incubadora e colocar o ovo num ovo restante sob um microscópio binocular magnificação definido para 3,2 vezes ou superior, se preferido. Remover a camada superior da fita adesiva transparente. Utilizando um aço micro faca fazer uma incisão através da membrana vitelina e LPM adjacente ao somitos 26 a 32 (Figura 1C) no lado direito do embrião (somitos não têm todos formados nesta fase). Corte ao lado das duas últimas somites formados e continuar o corte cinco comprimentos somite caudal. Pegar a barreira (1.2-1.3 mm de largura) com No. 5 micropinças em uma extremidade e torcer a barreira para inserir a extremidade livre na incisão. O mais rapidamente possível selar o ovo com clara fita de umND retorná-lo para a incubadora. NOTA: A dobradiça de barreira em forma fica plana sobre a membrana vitelina acima da LPM com metade dela salientes para baixo através do distal incisão para somitos. Se um grânulo é para ser inserido, em conjunto com uma barreira, em primeiro lugar, tomar o grânulo em No. 5 microfórceps e inseri-la na face cortada da LPM no lado distal da incisão e em seguida inserir a barreira para a incisão para proximal o rebordo (Figura 1D). Selar o ovo e devolvê-lo imediatamente para a incubadora. Se uma conta ou contas são para ser inserido sem uma barreira, por exemplo, BMS 493 grânulos para a região da perna na fase 15, não fazem a incisão longa (3.2.2.1). Fazer uma pequena incisão através da membrana vitelina e para o LPM na posição do cordão está a ser colocado. Leve o talão em No. 5 micropinças e inseri-lo no orifício na LPM. Empurre-o um pouco mais com as extremidades fechadas dos fórceps (Figura 1E). </li> Barreira inserido no estágio 9 para evitar a indução de gemas laterais e iniciação. Aqui uma fase 8 ou 9 embrião da incubadora e colocar o ovo num ovo restante sob um microscópio binocular magnificação definido para 3,2 vezes ou superior, se preferido. Utilizando um aço micro faca fazer uma incisão através da membrana vitelina e LPM lateral e rostral à linha primitiva, na extremidade caudal do embrião em linha com os sómitos (Figura 1F) cerca de 5 comprimentos de somito longo. Escolher-se a barreira (0,7-1 mm de largura) com microfórceps No. 5 no final saliente da placa de Petri e torcer a mão para inserir a extremidade livre da barreira dentro da incisão. O mais rapidamente possível selar o ovo com fita adesiva transparente e devolvê-lo para a incubadora. NOTA: A charneira em forma de barreira encontra-se horizontalmente sobre a membrana vitelina acima do LPM com metade saliente para baixo através da incisão. Se uma pérola está a ser inserted em conjunto com uma barreira; em primeiro lugar, tomar o talão em No. 5 micropinças e inseri-lo no rosto cortado da LPM no lado distal da incisão e, em seguida, insira a barreira para o proximal incisão ao cordão (Figura 1G). Selar o ovo e devolvê-lo imediatamente para a incubadora. Barreira inserido na fase de 10 para evitar a indução de gemas perna e iniciação. NOTA: Um exemplo do resultado desta operação na expressão Tbx4 é mostrada na Figura 2G. Tomar um embrião em fase 10 da incubadora e colocar o ovo num ovo restante sob um microscópio binocular magnificação definido para 3,2 vezes ou superior, se preferido. Utilizando um aço micro faca fazer uma incisão através da membrana vitelina e LPM lateral à linha primitiva, na extremidade caudal do embrião em linha com os sómitos (Figura 1H), aproximadamente, 6 somito comprimentos longos. Pegar a barreira (1.2mm de largura) com microfórceps No. 5 no final saliente da placa de Petri e torcer a mão para inserir a extremidade livre da barreira dentro da incisão. O mais rapidamente possível selar o ovo com fita adesiva transparente e devolvê-lo para a incubadora. NOTA: A charneira em forma de barreira encontra-se horizontalmente sobre a membrana vitelina acima do LPM com metade saliente para baixo através da incisão. Se um grânulo é para ser inserido sem uma barreira, por exemplo, BMS 493 cordão para a região de perna na fase 10, fazer uma pequena incisão através da membrana vitelina e para o LPM na posição do cordão está a ser colocado. Leve o talão em No. 5 micropinças e inseri-lo no orifício na LPM. Empurre-o um pouco mais com as extremidades fechadas dos fórceps (Figura 1-I). 24 horas ou mais depois de operar verificar a posição da barreira em comparação com o botão do membro contralateral emergente. Descartar qualquer embriões em que a barreira não é claramente opposite botão do membro esquerdo. Neste caso, a barreira foi posicionada erradamente. 4. colheita de embriões, Fixação e Preparação para Wholemount Hibridização In Situ (desejo) embriões de colheita postar operação. embriões colheita na fase 19-23 de tal forma que a morfologia do membro bud é claramente visível em ambos os lados de controle operado eo contralateral. Usando tesoura curva cortar um buraco maior na casca de ovo. Corte em torno do embrião, mantendo o grande vaso sanguíneo para a esquerda do embrião com microfórceps. Use este aperto do recipiente para remover o embrião e colocá-la numa placa de Petri de tampão fosfato salino (PBS) pH 7,3. Sob um microscópio binocular, dissecar distância vasos e membranas embrionárias adicionais usando uma combinação de tesoura curva e não. 5 micropinças. Retire a cabeça usando a tesoura. Fixação de embriões pós-colheita. Usando blun curvadat fórceps, levantar o embrião e colocá-la em 5 ml de paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS à temperatura ambiente durante duas horas e, em seguida, balançando a 4 ° C durante a noite num frasco de vidro de 20 ml com uma tampa de rosca. Cuidado: PFA é um perigo grave para a saúde. É um prejudiciais irritante, corrosivo e o pó deve ser impedido de entrar em contacto com a pele, os olhos e os pulmões. Use roupas de proteção pessoal e um exaustor durante a preparação da solução. Uma vez que é uma solução de 4%, luvas, óculos de proteção e um jaleco deve ser usado. NOTA: É importante para obter os embriões para correção rapidamente para melhor preservar a integridade do mRNA. Remoção de barreiras antes de Wholemount hibridização in situ. NOTA: As barreiras são removidos porque eles são afiados e podem danificar embriões como eles vão através do no protocolo de hibridização in situ, especialmente se vários embriões estão manchadas de uma só vez. Após a fixação, coloque o embrião em um prato de PBS sob a mi binocularcroscope. O uso de dois pares de No. 5 micropinças, colocar o par de perto à esquerda de cada lado da barreira do lado operado do embrião. Agarrar a barreira com o par direito e puxe a barreira a partir do embrião utilizando o par de esquerda para manter o embrião para baixo e para evitar qualquer tecido de aderir à barreira, uma vez que é removida. Realizar DESEJO essencialmente como descrito no 11.