Использование Индуцированные анализа соматической сектора (ISSA) для изучения генов и промоутеров, участвующих в формировании древесины и вторичного развития Stem

Дерево стебли содержат значительное количество биомассы планеты и имеют огромное биологическое, культурное и коммерческое значение. Вторичные стебли создают среду обитания путем выделения ресурсов и приют для многих других форм жизни. Они доставляют множество других услуг экосистем, которые они населяют и выступают в качестве возобновляемого ресурса для производства лесной, целлюлозно-бумажной и других древесных и недревесных продуктов. Вторичное развитие стволовых и более конкретно формирование древесины определяется сложной молекулярной системы, которые регулируют развитие специфических типов клеток, биохимический состав их клеточных стенок и как они устроены с образованием тканей и органов. Анатомический молекулярную основу вторичного развития стебля и формирования древесины посрамлен многими факторами, включая изменчивость древесины и стволовых свойств внутри и между стеблями, продолжительным периодом генерации, Ауткроссинг соединяемые системы, высокая гетерозиготность, высокая генетическая нагрузка, сезонное пок, долгое зрелыйTrait периоды создания и чистой физический размер зрелых деревьев. В результате, понимание вторичного развития стволовых относительно детального знания большинства других аспектов молекулярного контроля развития растений, все еще находится в зачаточном состоянии.

Ряд методов в пробирке были использованы для изучения и понимания вторичное развитие стебля, в частности древесины и формирования вторичной клеточной стенки. Эти протоколы предусматривают использование целого растения или части растения систем, где либо трансгенные растения , созданные или специфические вторичные клетки или ткани , которые трансформируются для изучения конкретных аспектов древесины и / или развитие вторичного штока ^1. Трансгенные растения могут быть восстановлены пост генетической трансформации из широкого спектра растительных тканей и типов клеток, однако, прогресс идет медленно, в частности, при анализе древесного волокна черты из-за длительного регенерации и времени созревания стволовых (в порядке лет), высокие технические и труда ДеманDS, низкая пропускная способность генов-кандидатов, а также трудности в распространении некоторых видов древесных растений. Аналогичные методы были разработаны в модельной системе недревесной , таких как Arabidopsis, успешно преодолеть некоторые из этих ограничений, но не все вторичные типы стволовых клеток в подарок в эти основы и черты характера , связанные с сезонностью или продолжительности жизни не могут быть изучены в таких видов ^2. В качестве альтернативы, часть системы растений, такие как Pinu сек Радиата каллусных ³ уменьшить связанные временные рамки. Эти методы , однако, ограничивается изучением отдельного типа клеток и страдают подобными ограничениями , как отмечено для экспериментов в пробирке. Точно так же, вершинные стволовые культуры ⁴ с участием целых стволовых эксплантов показали обещание , но пока еще не применялись для изучения специфических генов или стимуляторы , представляющих интерес. Совсем недавно, альтернативный протокол с участием волосатых корневых культур была разработана для эвкалипты и успешно⁵ применяется, однако, этот метод еще требует культивирования в лабораторных условиях , включает в себя вторичные корни , а не стебли и на сегодняшний день оно ограничивается одним видом деревьев.

Индуцированные анализ соматической сектора (МАСО), как описано здесь, был разработан, чтобы преодолеть некоторые из этих проблем, обеспечивая при средней до высокой пропускной способностью инструмента функционального скрининга для генов и промоторов с подозрением на роли в формировании древесины и развития вторичного стволовых тканей. МАСО в естественных условиях трансформации и скрининга системы , которая была разработана , чтобы сократить время , необходимое для получения трансгенных клеток и тканей в интактном вторичного стебля, преодолевая рабочую силу, технические и ограничения пропускной способности обычно используются в методах лабораторных условиях . Описанные здесь протоколы позволяют для одновременного создания сотен независимо друг от друга трансформированных секторов тканей и клеток в вторичные стебли в течение короткого периода времени, в породам и интересующей ткани без гenetic и / или окружающей среды изменение в относительно короткие сроки и низкая стоимость рабочей силы. ISSA методы в естественных условиях впервые были описаны для вторичного стволовых ⁶ и бутон ⁷ тканей и с тех пор был усовершенствован во вторичной стволовых ткани с помощью исследований генов и / или промоторов , участвующих в камбиального дифференциации и включают в себя: тубулина (БТУ) , ^8, fasciclin типа арабиногалактан ( FLA) ^9, целлюлоза – синтазы (CESA) ^10, вторичная клеточная стенка-ассоциированный домен NAC (SND2) ^11, ARBORKNOX (ARK1) ¹² и действительно интересный новый ген (КОЛЬЦО) H2 белка ^13. Эти исследования были проведены в средних стеблей тополя и эвкалиптовых растений и поделились соображениями относительно морфологии клеток, химии клеточной стенки и экспрессии генов.

Протоколы, описанные здесь, предназначены, чтобы объединить опыт?го знания, полученные на основе разработки и применения МАСО из ряда опубликованных и неопубликованных исследований за последнее десятилетие. Они сосредоточены на трансформации в естественных условиях вторичных стволовых тканей ⁶ и сосредоточиться на исследованиях с участием клона тополь белый 'пирамидальный', эвкалипт шаровидный, а также 11 эвкалипт шаровидный х camaldulensis клонов. Этот документ принимает исследователей через протокол от выращивания растений и бактерий, трансформации стволовых тканей, роста и урожая ткани, идентификации трансгенных клеток и тканей, подготовка к фенотипическим оценок и методов для сбора и анализа данных. В то время как методы были успешно применены для измерения моносахаридную состав клеточной стенки также ^9,11, из – за пространственных ограничений, этот документ концентрируется на методах , используемых для измерения клетки и морфологию ткани и для понимания паттернов экспрессии генов в средней сттолько СЭМ. В соответствии с этим протоколом, как указано подходит для тех, кто хочет, чтобы получить более полное представление о роли и / или экспрессии генов, связанных с вторичным стеблями с использованием низкой стоимости, технически простой и средней до высокой пропускной способности метода.