השימוש בניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA) לימוד גנים ומקדמי המעורבים ביצירת עץ ופיתוח גזע משניים
Summary
Here we present a protocol that facilitates the medium to high throughput functional characterization of gene and promoter constructs in tree secondary stem tissue within comparatively short time frames. It is efficient, easy to use and widely applicable to a range of tree species.
Abstract
צמיחה של גבעול משני עצי היווצרות העץ הקשורים הן משמעותיות הוא מנקודות מבט ביולוגי ומסחרי. עם זאת, יחסית מעט מאוד ידוע על השליטה המולקולרית שולטת התפתחותם. מדובר בין שאר בשל פיסיים, משאבים ומגבלות זמן קשורים לעתים קרובות עם בחקר תהליכי גדילה משניים. מספר טכניקות במבחנה שימשו מעורבים או חלק הצמח או מערכת הצמח כולו בשני וודי מיני צמחים שאינם מעוצים. עם זאת, שאלות על תחולתן לחקר תהליכי צמיחה של גבעול משני, הסרבנות של מינים מסוימים עוצמת עבודה הן לעתים קרובות מונעת על מדיום ליישומי תפוקה גבוהים. כמו כן, כאשר מסתכלים היווצרות פיתוח ועץ גזע משתי התכונות הספציפיות תחת החקירה עלולות רק להיות מדידות מאוחר מחזור החיים של עץ לאחר מספר שנים של צמיחה. בהתמודדות אלטרנטיבת האתגרים הללו in vivo protocols פותחו, בשם מושרה ניתוח מגזר סומטיים, אשר יש בהם משום יצירת סקטורים רקמות סומטיות מהונדס ישירות בגזע המשני של הצמח. מטרת פרוטוקול זה היא לספק אמצעי יעיל, קל ומהיר יחסית כדי ליצור רקמות צמח משני מהונדסות עבור גן ואפיון פונקציונלי אמרגן שניתן לנצלם במגוון של מיני עצים. התוצאות המוצגות כאן עולה כי המגזרים גזע משני מהונדס יכול להיווצר בכל רקמות חיות סוגי תאים משני גבעולי מגוון של מיני עצים וכי תכונות מורפולוגיות עץ כמו גם דפוסי ביטוי האמרגן ב משנית נובעת ניתן להעריך בקלות להקל בינוני עד גבוה אפיון פונקציונלי תפוקה.
Introduction
עץ נובע מהווה כמות משמעותית של ביומסה הכוכבית הלכת הם בעלי חשיבות ומסחרית ביולוגית, תרבותיות עצומה. משני נובע ליצור בית גידול על ידי מתן משאבים ומחסה למצוא צורות חיים רבות אחרות. הם מספקים שירותים רבים אחרים אל המערכות האקולוגיות הם מאכלסים ולפעול כמשאב מתחדש לייצור עץ, עיסת נייר ועץ אחרים מוצרים שאינם עץ. פיתוח גזע משני ובאופן ספציפי היווצרות עץ נשלט על ידי מערכת מולקולרית מורכבת המווסתת את הפיתוח של סוגי תאים מסוימים, את ההרכב הביוכימי של קירות התא שלהם וכיצד הם מסודרים ליצירת רקמות ואיברים. לנתח את הבסיס המולקולרי של פיתוח גזע משתי היווצרות עץ נאלץ להתמודד על ידי גורמים רבים, כוללים ההשתנות של מאפייני עץ גזע בתוך ובין נובעת, משך דור ארוך, מערכות הזדווגות מחוץ למעבר, הטרוזיגוטיות גבוהה, עומס גנטי גבוה, תרדמת עונתית, ארוך בּוֹגֵרתקופות הקמת תכונה ואת הגודל הפיזי העצום של עצים בוגרים. כתוצאה מכך, הבנה של יחסי פיתוח גזע משניים הידע המפורט של רוב ההיבטים האחרים של הבקרה המולקולרית של התפתחות צמח, הוא עדיין בחיתוליו.
מספר טכניקות במבחנה שמשו ללמוד ולהבין פיתוח גזע משני, בעץ מסוים היווצרות דופן תא משנית. פרוטוקולים אלה כרוכים בשימוש צמח כולו או מערכות חלק צמח, שם גם צמחיים מהונדסים נוצרים או תאים משני ספציפיים או רקמות הופכים לחקר היבטים הספציפיים של עץ ו / או פיתוח גזע מהשני 1. ניתן לשחזר צמחים טרנסגניים פוסט שינוי גנטי ממגוון רחב של רקמות צמח סוגי תאים, עם זאת, ההתקדמות היא איטית, במיוחד בעת ניתוח תכונות סיביות עץ בשל התחדשות ארוכה נובעים פעמי התבגרות (לפי סדר שנים), גבוה טכנית deman העבודהds, תפוקה נמוכה של גנים מועמדים כמו גם קשיים הפצת כמה מיני צמחים עציים. טכניקות דומות פותחו במערכת מודל שאינו עצית, כגון ארבידופסיס כי בהצלחה להתגבר על כמה מגבלות אלה, אך לא כל סוגי תאי גזע משני מתנה אלה גבעולים תכונות הקשורות עונתי או אריכות ימים לא ניתן ללמוד מינים כגון 2. לחלופין, מערכות חלק הצמח, כגון תרבויות יבלת radiata s pinu 3 לצמצם את לוחות הזמנים הכרוכים בכך. שיטות אלה עם זאת מוגבלים המחקר של סוג תאים בודדים סובלים אילוצים דומים כאמור לניסויים במבחנה. בדומה לכך, תרבויות גזע פסגה 4 מעורבי explants כל הגבעול הראו הבטחה אבל עדיין לא יושמו לחקר גנים ספציפיים או מקדמים של עניין. לאחרונה, פרוטוקול חלופי מעורבים תרבויות שורש שעיר פותחה עבור האקליפטוסים והוא מיושם בהצלחה5 מיושם, עם זאת, שיטה זו עדיין דורשת בטיפוח במבחנה, כרוך שורשים משניים ולא גבעולים עד היום הוא מוגבל מין עץ בודד.
ניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA), כפי שמתואר כאן, פותח כדי להתגבר על כמה בעיות אלה מתן מדיום לכלי הקרנה פונקציונלית קצב העברת נתונים גבוהים עבור גנים ומקדמים עם תפקידים חשודים במבנה עץ התפתחות רקמת גזע משני. ISSA היא מערכת טרנספורמציה והקרנת vivo שבו פותחה כדי לצמצם את הזמן שנדרש כדי לייצר תאים מהונדסים ורקמות בתוך גזע משני שלמים תוך ההתגברות על עבודה, מגבלות טכניות ותפוקה של בשימוש שיגרתי בשיטות במבחנה. הפרוטוקולים המתוארים כאן לאפשר את הקמתה סימולטני של מאה מגזרי רקמות שינו באופן עצמאי תאים משני נובע בתוך פרק הזמן קצר, ב מיני עצים ורקמות של עניין ללא genetic ו / או סביבתי וריאציה בתוך מסגרות זמן קצרות יחסית ועלות עבודה נמוכה. טכניקות vivo ב ISSA תוארו לראשונה עבור רקמות משני גזע 6 ו ניצן 7 ויש לי מאז שוכללה ברקמת גזע משני באמצעות מחקרים של גנים ו / או מקדמי המעורבים בידול cambial וכוללים: טובולין (גיגית) 8, arabinogalactan דמוי fasciclin ( FLA) 9, synthase תאית (CESA) 10, תחום NAC הקשורים דופן התא המשני (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 ובאמת גן חדש מעניין (RING) H2 חלבון 13. מחקרים אלה נערכו משני גבעולי צמחי צפצפת eucalypt ותובנות הניתנים לתוך מורפולוגיה תא, כימית דופן תא ביטוי גנים.
הפרוטוקולים המתוארים כאן נועדו להפגיש את חווייתידע nd שנרכש באמצעות הפיתוח והיישום של ISSA מתוך מגוון רחב של מחקרים שפורסמו וכן פורסמו בעשור האחרון. הם מתמקדים טרנספורמציה in vivo של רקמות גזע משני 6 ולהתרכז מחקרים שכללו שיבוט 'pyramidalis' Populus alba, אקליפטוס Globulus וכן 11 שיבוטים אקליפטוס Globulus x camaldulensis. מסמך זה לוקח חוקרים באמצעות הפרוטוקול מן גידול צמחים וחיידקים, טרנספורמציה של רקמות גזע, צמיחת קציר של רקמות, זיהוי תאים מהונדסים ורקמות, הכנה והערכות פנוטיפי ושיטות לאיסוף והניתוח של נתונים. בעוד טכניקות יושמו בהצלחה למדוד רכב monosaccharide דופן תא גם 9,11, בשל מגבלות מקום, מסמך זה מתרכז בטכניקות המשמשות למדידת תא ומורפולוגיה רקמות בהבנת דפוסי ביטוי גנים משני stEMS בלבד. לפיכך, הפרוטוקול כפי שמתואר מתאים לאלו המעוניינים לקבל תובנה מעמיקות יותר לתוך התפקיד ו / או הביטוי של גנים הקשורים משני גבעולים באמצעות עלות נמוכה, מבחינה טכנית קלה, בינונית עד שיטת העברת נתונים גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול ISSA הוא שיטה פשוטה יחסית ויעילה ליצירת רקמות גזע מהונדסת מיני עצים במרחב של כמה חודשים לניתוח של גנים ומקדמים של האינטרס הכרוך עץ גזע היווצרות. מעט מאמץ, מעבר שמירת צמחים בחיים, נדרש לגדל רקמות גזע מהונדסות הבאות חיסון אשר עומד בניגוד לשיטות במבחנה שבה cul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge funding support for aspect of the work through Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) and LP0211919 (GB) and industry partners Sappi and Mondi as well as Australian Postgraduate Award (EM) from the Australian Research Council and the Young Innovators and Scientist Award through the Australian Department of Agriculture (LT). We also like to thank the Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan and Simon Southerton for the many discussions and ideas they put forward during the development of this protocol and to Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel and Noemie Defaix for assistance in laboratory related work.
Materials
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order – http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide (III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide (II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| Image J imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation – benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Hawkins, S., Pilate, G., Duverger, E., Boudet, A., Grima-Pettenati, J., Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
