Het gebruik van Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) voor het bestuderen van genen en Promoters Betrokken bij Wood Vorming en secundaire Stem Development

Boom stengels bevatten een aanzienlijke hoeveelheid van de planeten biomassa en zijn van grote biologische, culturele en commerciële belang. Secundaire stengels maken leefgebied door het verstrekken van middelen en onderdak voor vele andere levensvormen. Ze leveren tal van andere diensten van de ecosystemen waarin ze wonen en werken als een hernieuwbare grondstof voor de productie van hout, pulp en papier en andere hout en niet-houtproducten. Secundaire steel ontwikkeling en meer specifiek houtvorming wordt beheerst door complexe moleculaire systeem dat de ontwikkeling van specifieke celtypen reguleren, de biochemische samenstelling van hun celwanden en hoe zij worden weefsels en organen te vormen. Ontrafeling van de moleculaire basis van secundaire ontwikkeling steel en houtvorming wordt verstoord door vele factoren, waaronder de variabiliteit van hout en steel eigenschappen binnen en tussen de stengels, lange generatie tijden, out-kruising paring systemen, hoge heterozygotie, hoge genetische belasting, seizoensgebonden slaaptoestand, lang volwassentrait vestiging periodes en de enorme fysieke grootte van volwassen bomen. Hierdoor begrip secundaire steel ontwikkeling ten opzichte van de gedetailleerde kennis van de meeste andere aspecten van de moleculaire controle van plantenontwikkeling, nog in de kinderschoenen.

Een aantal in vitro technieken zijn gebruikt voor onderzoek en begrijpen secundaire stam ontwikkeling, met name hout en secundaire vorming celwand. Deze protocollen gepaard met het gebruik van de gehele plant of deel systemen, waarbij ofwel transgene planten worden gemaakt of specifieke secundaire cellen of weefsels worden getransformeerd voor de studie van specifieke aspecten van hout en / of secundaire stuurpen ontwikkeling ^1. Transgene planten kunnen worden gewonnen na genetische transformatie van diverse plantaardige weefsels en celtypen, maar het is een langzame, met name bij de analyse houtvezel eigenschappen vanwege de lange regeneratie en steel rijpingstijden (in de orde van jaren), hoge technische en arbeid demands, lage omzet van kandidaatgenen alsook problemen in het propageren van een aantal houtachtige plantensoorten. Soortgelijke technieken zijn ontwikkeld in niet-houtige modelsysteem zoals Arabidopsis die succesvol sommige van deze beperkingen te overwinnen, maar niet alle secundaire stamcellen celtypen een aanwezig in deze stammen en kenmerken in verband met seizoensinvloeden levensduur kan niet worden onderzocht bij deze soorten ^2. Als alternatief plantendeel systemen, zoals Pinu s radiata calluscultures ³ vermindering van de bijbehorende termijnen. Deze werkwijzen zijn echter beperkt tot de studie van een celtype en lijden soortgelijke beperkingen als vermeld in vitro experimenten. Ook apicale stam culturen ⁴ waarbij hele stam explantaten hebben aangetoond belofte, maar nog niet zijn toegepast voor de studie van specifieke genen of promotoren van belang. Meer recent is een alternatief protocol waarbij hairy wortelkweken ontwikkeld voor eucalyptus en is met succes⁵ toegepast, deze wijze nog nodig vitro kweek, omvat zijwortels plaats stengels en tot op heden is beperkt tot één boomsoorten.

Geïnduceerde somatische sector analyse (ISSA), zoals hier beschreven, is ontwikkeld om een ​​aantal van deze problemen het verstrekken van een medium tot high throughput screening functionele tool voor genen en promoters met een vermoedelijke rol in hout vorming en ontwikkeling secundaire stam weefsel te overwinnen. ISSA is een in vivo transformatie en screening systeem dat is ontwikkeld om de tijd voor transgene cellen en weefsels produceren een intacte secundaire stam het ondervangen arbeid verminderen, technische en doorvoer beperkingen van routinematig gebruikt in vitro werkwijzen. De hier beschreven protocollen zorgen voor het gelijktijdig creëren van honderden onafhankelijk getransformeerd weefsel sectoren en cellen in secundaire stengels binnen een korte tijd, in de boomsoorten weefsel van belang zonder gGenetic en / of milieu variatie binnen relatief korte tijd frames en de lage arbeidskosten. ISSA in vivo technieken werden voor het eerst beschreven voor het voortgezet steel ⁶ en bud ⁷ weefsels en hebben sindsdien in het voortgezet stam weefsel werd verfijnd door studies van genen en / of promoters die betrokken zijn bij cambial differentiatie en omvatten: tubuline (TON) ^8, fascicline-achtige arabinogalactan ( FLA) ^9, cellulose synthase (CESA) ^10, secundaire celwand geassocieerd NAC domein (SND2) ^11, ARBORKNOX (ARK1) ¹² en echt interessant nieuw gen (RING) H2 eiwit ^13. Deze studies werden uitgevoerd in het voortgezet stengels van populieren en eucalyptus planten en gaf inzicht in de cel morfologie, celwand chemie en genexpressie.

De hier beschreven protocollen zijn bedoeld om de ervaring een samenbrengennd kennis die is opgedaan door de ontwikkeling en toepassing van ISSA uit een reeks van gepubliceerde en ongepubliceerde studies in het afgelopen decennium. Zij richten zich op de in vivo transformatie van secundaire stam weefsels ⁶ en zich concentreren op studies met Populus alba 'pyramidalis' kloon, Eucalyptus globulus evenals 11 Eucalyptus globulus x camaldulensis klonen. Dit document neemt onderzoekers via het protocol van het kweken van planten en bacteriën, de transformatie van stamcellen weefsels, de groei en de oogst van het weefsel, de identificatie van transgene cellen en weefsels, voorbereiding op fenotypische evaluaties en methoden voor het verzamelen en analyseren van gegevens. Terwijl technieken zijn met succes toegepast op de celwand monosaccharide samenstelling meet ook ^9,11, als gevolg van de beperkte ruimte, dit document richt zich op technieken die worden gebruikt voor het meten van cellen en weefsel morfologie en het begrijpen van genexpressie patronen in het voortgezet stalleen ems. Dienovereenkomstig, het protocol zoals geschetst is geschikt voor mensen op zoek naar meer inzicht in de rol en / of expressie van genen in verband met secundaire krijgen stelen met behulp van een low cost, technisch eenvoudig, en medium tot high throughput methode.