Summary

O uso de Induced Somatic Análise Sector (ISSA) para estudar genes e promotores envolvidos na formação da madeira e Desenvolvimento secundária da haste

Published: October 05, 2016
doi:

Summary

Here we present a protocol that facilitates the medium to high throughput functional characterization of gene and promoter constructs in tree secondary stem tissue within comparatively short time frames. It is efficient, easy to use and widely applicable to a range of tree species.

Abstract

crescimento do caule secundário em árvores e formação da madeira associada são significativos tanto a partir de perspectivas biológicas e comerciais. No entanto, pouco se sabe sobre o controle molecular que regula o seu desenvolvimento. Isto é em parte devido à física, recursos e limitações de tempo, muitas vezes associada ao estudo dos processos de crescimento secundários. Um número de técnicas in vitro têm sido utilizados envolvendo qualquer parte da planta ou planta inteira em sistema tanto espécies lenhosas e plantas não-lenhosas. No entanto, as perguntas sobre a sua aplicabilidade para o estudo dos processos de crescimento secundária da haste, a recalcitrância de determinadas espécies e intensidade de trabalho são muitas vezes proibitivos para médias e aplicações de alto débito. Além disso, quando se olha para a formação de desenvolvimento do caule e madeira secundário as características específicas sob investigação só poderia tornar-se mensurável no final do ciclo de vida de uma árvore depois de vários anos de crescimento. Em resposta a estes desafios alternativa in vivo protocols foram desenvolvidos, com o nome Induced Somatic Análise Sectorial, que envolvem a criação de setores de tecidos somáticos transgênicos diretamente no secundária da haste da planta. O objectivo do presente protocolo é o de proporcionar um meio eficiente, simples e relativamente rápido para a criação de tecido de planta transgénica secundário para o gene e o promotor de caracterização funcional que pode ser utilizado numa gama de espécies de árvores. Os resultados aqui apresentados mostram que os sectores secundária da haste transgénicas podem ser criados em todos os tecidos vivos e de tipos de células em hastes secundárias de uma variedade de espécies de árvores e que a madeira características morfológicas como também os padrões de expressão do promotor em hastes secundárias pode ser facilmente avaliada facilitar média a alta caracterização funcional de transferência.

Introduction

Árvore de caules compreendem uma quantidade significativa de biomassa planetas e são de grande importância biológica, cultural e comercial. Hastes secundárias criar habitat, fornecendo recursos e abrigo para muitas outras formas de vida. Eles oferecem muitos outros serviços aos ecossistemas que habitam e agem como um recurso renovável para a produção de madeira, papel e celulose e outros produtos madeireiros e não-madeireiros. desenvolvimento secundária da haste e, mais especificamente, a formação da madeira é regulada pelo sistema complexo molecular que regulam o desenvolvimento de tipos específicos de células, a composição bioquímica das suas paredes celulares e como eles estão dispostos para formar tecidos e órgãos. Dissecando a base molecular do desenvolvimento secundária da haste e formação da madeira é confundida por muitos fatores, incluindo a variabilidade das propriedades da madeira e tronco dentro e entre as hastes, longos tempos de geração, sistemas de Cruzamento de acasalamento, alta heterozigosidade, alta carga genética, dormência sazonal, a longo maduroperíodos estabelecimento traço e o tamanho físico absoluto de árvores maduras. Como resultado, a compreensão do desenvolvimento secundária da haste em relação ao conhecimento detalhado da maioria dos outros aspectos do controle molecular do desenvolvimento da planta, ainda está em sua infância.

Um número de técnicas in vitro têm sido utilizados para estudar o desenvolvimento e compreender secundária da haste, em especial de madeira e a formação da parede celular secundária. Esses protocolos envolvem a utilização de sistemas de parte de planta ou planta inteira, em que ou as plantas transgénicas são criadas ou células ou tecidos específicos secundários são transformados para o estudo de aspectos específicos de madeira e / ou desenvolvimento de uma haste secundária. As plantas transgénicas podem ser recuperados transformação pós genética a partir de uma ampla variedade de tecidos de plantas e tipos de células, no entanto, o progresso é lento, especialmente quando se analisa os traços de fibras de madeira devido à longa regeneração e haste tempos de maturação (na ordem de anos), alta técnica e Deman de trabalhods, baixa taxa de transferência de genes candidatos, bem como dificuldades na propagação de algumas espécies de plantas lenhosas. Técnicas similares têm sido desenvolvidos no sistema de modelo não-lenhoso, como Arabidopsis que com sucesso superar algumas destas limitações, mas nem todos os tipos de células-tronco secundárias um presente nestes caules e caracteres relacionados à sazonalidade ou a longevidade não pode ser estudada em tais espécies 2. Alternativamente, sistemas de parte da planta, tais como Pinu s radiata calos 3 reduzir os prazos associados. Estes métodos são, no entanto restringida ao estudo de um tipo de célula individual e sofrem restrições semelhantes como observado em experiências in vitro. Da mesma forma, as culturas-tronco apicais 4 envolvendo explantes-tronco inteiros mostraram-se promissores, mas ainda não foram aplicadas para o estudo de genes ou promotores de interesse específicos. Mais recentemente, um protocolo alternativo envolvendo culturas de raízes peludas tem sido desenvolvido para o eucalipto e tem sido êxitoaplicada 5, no entanto, este método ainda requer cultivo in vitro, envolve raízes secundárias em vez de hastes e até hoje ela é limitada a uma única espécie de árvore.

Induzida análise do sector somáticas (ISSA), conforme descrito aqui, foi desenvolvido para superar alguns desses problemas fornecendo um meio de alto rendimento ferramenta de triagem funcional para genes e promotores com papéis suspeitos na formação da madeira e desenvolvimento do tecido secundária da haste. ISSA é uma transformação e rastreio sistema in vivo que foi desenvolvido para reduzir o tempo necessário para a produção de células transgénicas e o tecido de uma haste secundária intacta, enquanto a superação de trabalho, limitações técnicas e taxa de transferência de rotina usado em métodos in vitro. Os protocolos aqui descritos permitem a criação simultânea de centenas de sectores tecido transformado de forma independente e células em hastes secundárias dentro de um curto período de tempo, nas espécies de árvores e tecido de interesse sem gvariação enetic e / ou ambiental dentro de prazos relativamente curtos e de baixo custo de trabalho. ISSA em técnicas in vivo foram primeiramente descrita por secundária da haste 6 e botão 7 tecidos e desde então foi refinado no tecido secundária da haste através de estudos de genes e / ou promotores envolvidos na diferenciação cambial e incluem: tubulina (TUB) 8, a fasciclina-like arabinogalactan ( FLA) 9, sintase celulose (CESA) 10, célula domínio NAC associada a parede secundária (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 e realmente proteína interessante novo gene (ANEL) H2 13. Estes estudos foram realizados no secundário caules de plantas de álamo e de eucalipto e fornecidos insights sobre a morfologia das células, química da parede celular e expressão gênica.

Os protocolos descritos aqui têm a intenção de reunir a experiência de umnd conhecimento adquirido através do desenvolvimento e aplicação de ISSA de uma série de estudos publicados e não publicados durante a última década. Eles se concentram na transformação in vivo de tecidos secundária da haste 6 e concentrar-se em estudos envolvendo clone Populus alba 'pyramidalis', Eucalyptus globulus, bem como 11 Eucalyptus camaldulensis clones globulus x. Este documento leva pesquisadores através do protocolo a partir do cultivo de plantas e bactérias, a transformação de tecidos do caule, crescimento e colheita de tecido, de identificação das células transgénicas e tecidos, de preparação para as avaliações fenotípicas e métodos para a recolha e análise de dados. Embora as técnicas de sucesso têm sido aplicados para medir a composição monosaccharide parede celular também 9,11, devido a limitações de espaço, este documento concentra-se em técnicas utilizadas para medir celular e morfologia do tecido e compreender os padrões de expressão de genes em r secundárioems somente. Assim, o protocolo como descrito é ideal para quem procura obter mais insights sobre o papel e / ou expressão de genes ligados ao secundário hastes usando um baixo custo, tecnicamente fácil, e médio e método de alto rendimento.

Protocol

1. Preparação de material vegetal Antes da experimentação, levantar novas mudas das espécies de árvores preferenciais a partir de sementes ou o corte e crescer árvore / s até que o diâmetro da haste na área destinada para a experimentação é de aproximadamente 1 cm de diâmetro. Nota: O tempo necessário pode variar devido a, por conseguinte, as taxas de crescimento de plantas permitem que entre três a nove meses para esta etapa. 2. Binário Vector Creation…

Representative Results

Usando este protocolo todos os tipos de células estaminais e de tecidos vivos secundárias têm sido mostrados para ser susceptíveis a A. tumefaciens e transformações foram definidos em tipos sector com base no tipo de células inicialmente transformada e que o padrão de crescimento subsequente desenvolvimento. Tipos sector incluem periderme, floema, cambial, parênquima de feridas e tilose (Figura 1b, 1c, 1d) e podem ser e…

Discussion

O protocolo ISSA é um método relativamente simples e eficiente para a criação de tecidos estaminais transgénicas em espécies de árvores, no espaço de alguns meses por análise de genes e promotores de interesse envolvido na madeira e haste formação. Pouco de esforço, além de manter as plantas vivas, é necessária a crescer tecido do caule transgênica após a inoculação, que está em contraste com métodos in vitro em que é necessária extensa cultura de manter tecido ou plantas, onde a produç?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge funding support for aspect of the work through Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) and LP0211919 (GB) and industry partners Sappi and Mondi as well as Australian Postgraduate Award (EM) from the Australian Research Council and the Young Innovators and Scientist Award through the Australian Department of Agriculture (LT). We also like to thank the Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan and Simon Southerton for the many discussions and ideas they put forward during the development of this protocol and to Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel and Noemie Defaix for assistance in laboratory related work.

Materials

Plants NA NA Please consult local nursery suppliers for plants as needed
Agrobacterium strain NA NA There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region.
Binary vector (gene and promoter) NA NA We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community.
LB media Sigma L3022 The same product could be sourced from another company
LB media with agar Sigma L2897 A like product could be sourced from another company
Antibiotics Sigma NA The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a  range of companies
50 ml Screw top tubes Fisher Scientific 14-432-22 The same product could be sourced from another company
2 ml Microtube Watson Bio Lab 132-620C The same product could be sourced from another company
MS Media Sigma M9274 The same product could be sourced from another company
Scalpel blade no 11 Sigma S2771 The same product could be sourced from another company
Parafilm "M" Bemis PM996 This is the best product to use to bind the cambial window post creation 
14 ml round bottom tubes Thermo Scientific 150268 The same product could be sourced from another company
EDTA Sigma E6758 The same product could be sourced from another company
Triton Sigma X100 The same product could be sourced from another company
X-Gluc X-GLUC direct You will need to go to the website to order – http://www.x-gluc.com/index.html
Potassium Ferricyanide (III) Sigma 244023 The same product could be sourced from another company
Potassium Ferrocyanide (II) Sigma P9387 The same product could be sourced from another company
Litmus paper Sigma WHA10360300 The same product could be sourced from another company
Single edge razor blade ProSciTech L055 The same product could be sourced from another company
Double edge razor blade ProSciTech L056 The same product could be sourced from another company
SEM Pin Stub ProSciTech GTP16111 The same product could be sourced from another company
Sample vial with screw cap ProSciTech L6204 The same product could be sourced from another company
Ethanol sigma E7023 The same product could be sourced from another company
LR white ProSciTech C025 The same product could be sourced from another company
Embedding Mould ProSciTech RL090 We recommend this variety, however there are plenty of options available
Water Soulable mounting media ProSciTech IA019 One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored.
Hydrogen peroxide Sigma 216763 A like product could be sourced from another company
Glacial acetic acid Sigma A9967 A like product could be sourced from another company
Safranin O ProSciTech C138 A like product could be sourced from another company
Quanta Environmental Scanning Electron Microscope FEI This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised
Image J imaging software  can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/

References

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Cite This Article
Spokevicius, A., Taylor, L., Melder, E., Van Beveren, K., Tibbits, J., Creux, N., Bossinger, G. The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development. J. Vis. Exp. (116), e54553, doi:10.3791/54553 (2016).

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