Here we present a protocol that facilitates the medium to high throughput functional characterization of gene and promoter constructs in tree secondary stem tissue within comparatively short time frames. It is efficient, easy to use and widely applicable to a range of tree species.
crescimento do caule secundário em árvores e formação da madeira associada são significativos tanto a partir de perspectivas biológicas e comerciais. No entanto, pouco se sabe sobre o controle molecular que regula o seu desenvolvimento. Isto é em parte devido à física, recursos e limitações de tempo, muitas vezes associada ao estudo dos processos de crescimento secundários. Um número de técnicas in vitro têm sido utilizados envolvendo qualquer parte da planta ou planta inteira em sistema tanto espécies lenhosas e plantas não-lenhosas. No entanto, as perguntas sobre a sua aplicabilidade para o estudo dos processos de crescimento secundária da haste, a recalcitrância de determinadas espécies e intensidade de trabalho são muitas vezes proibitivos para médias e aplicações de alto débito. Além disso, quando se olha para a formação de desenvolvimento do caule e madeira secundário as características específicas sob investigação só poderia tornar-se mensurável no final do ciclo de vida de uma árvore depois de vários anos de crescimento. Em resposta a estes desafios alternativa in vivo protocols foram desenvolvidos, com o nome Induced Somatic Análise Sectorial, que envolvem a criação de setores de tecidos somáticos transgênicos diretamente no secundária da haste da planta. O objectivo do presente protocolo é o de proporcionar um meio eficiente, simples e relativamente rápido para a criação de tecido de planta transgénica secundário para o gene e o promotor de caracterização funcional que pode ser utilizado numa gama de espécies de árvores. Os resultados aqui apresentados mostram que os sectores secundária da haste transgénicas podem ser criados em todos os tecidos vivos e de tipos de células em hastes secundárias de uma variedade de espécies de árvores e que a madeira características morfológicas como também os padrões de expressão do promotor em hastes secundárias pode ser facilmente avaliada facilitar média a alta caracterização funcional de transferência.
Árvore de caules compreendem uma quantidade significativa de biomassa planetas e são de grande importância biológica, cultural e comercial. Hastes secundárias criar habitat, fornecendo recursos e abrigo para muitas outras formas de vida. Eles oferecem muitos outros serviços aos ecossistemas que habitam e agem como um recurso renovável para a produção de madeira, papel e celulose e outros produtos madeireiros e não-madeireiros. desenvolvimento secundária da haste e, mais especificamente, a formação da madeira é regulada pelo sistema complexo molecular que regulam o desenvolvimento de tipos específicos de células, a composição bioquímica das suas paredes celulares e como eles estão dispostos para formar tecidos e órgãos. Dissecando a base molecular do desenvolvimento secundária da haste e formação da madeira é confundida por muitos fatores, incluindo a variabilidade das propriedades da madeira e tronco dentro e entre as hastes, longos tempos de geração, sistemas de Cruzamento de acasalamento, alta heterozigosidade, alta carga genética, dormência sazonal, a longo maduroperíodos estabelecimento traço e o tamanho físico absoluto de árvores maduras. Como resultado, a compreensão do desenvolvimento secundária da haste em relação ao conhecimento detalhado da maioria dos outros aspectos do controle molecular do desenvolvimento da planta, ainda está em sua infância.
Um número de técnicas in vitro têm sido utilizados para estudar o desenvolvimento e compreender secundária da haste, em especial de madeira e a formação da parede celular secundária. Esses protocolos envolvem a utilização de sistemas de parte de planta ou planta inteira, em que ou as plantas transgénicas são criadas ou células ou tecidos específicos secundários são transformados para o estudo de aspectos específicos de madeira e / ou desenvolvimento de uma haste secundária. As plantas transgénicas podem ser recuperados transformação pós genética a partir de uma ampla variedade de tecidos de plantas e tipos de células, no entanto, o progresso é lento, especialmente quando se analisa os traços de fibras de madeira devido à longa regeneração e haste tempos de maturação (na ordem de anos), alta técnica e Deman de trabalhods, baixa taxa de transferência de genes candidatos, bem como dificuldades na propagação de algumas espécies de plantas lenhosas. Técnicas similares têm sido desenvolvidos no sistema de modelo não-lenhoso, como Arabidopsis que com sucesso superar algumas destas limitações, mas nem todos os tipos de células-tronco secundárias um presente nestes caules e caracteres relacionados à sazonalidade ou a longevidade não pode ser estudada em tais espécies 2. Alternativamente, sistemas de parte da planta, tais como Pinu s radiata calos 3 reduzir os prazos associados. Estes métodos são, no entanto restringida ao estudo de um tipo de célula individual e sofrem restrições semelhantes como observado em experiências in vitro. Da mesma forma, as culturas-tronco apicais 4 envolvendo explantes-tronco inteiros mostraram-se promissores, mas ainda não foram aplicadas para o estudo de genes ou promotores de interesse específicos. Mais recentemente, um protocolo alternativo envolvendo culturas de raízes peludas tem sido desenvolvido para o eucalipto e tem sido êxitoaplicada 5, no entanto, este método ainda requer cultivo in vitro, envolve raízes secundárias em vez de hastes e até hoje ela é limitada a uma única espécie de árvore.
Induzida análise do sector somáticas (ISSA), conforme descrito aqui, foi desenvolvido para superar alguns desses problemas fornecendo um meio de alto rendimento ferramenta de triagem funcional para genes e promotores com papéis suspeitos na formação da madeira e desenvolvimento do tecido secundária da haste. ISSA é uma transformação e rastreio sistema in vivo que foi desenvolvido para reduzir o tempo necessário para a produção de células transgénicas e o tecido de uma haste secundária intacta, enquanto a superação de trabalho, limitações técnicas e taxa de transferência de rotina usado em métodos in vitro. Os protocolos aqui descritos permitem a criação simultânea de centenas de sectores tecido transformado de forma independente e células em hastes secundárias dentro de um curto período de tempo, nas espécies de árvores e tecido de interesse sem gvariação enetic e / ou ambiental dentro de prazos relativamente curtos e de baixo custo de trabalho. ISSA em técnicas in vivo foram primeiramente descrita por secundária da haste 6 e botão 7 tecidos e desde então foi refinado no tecido secundária da haste através de estudos de genes e / ou promotores envolvidos na diferenciação cambial e incluem: tubulina (TUB) 8, a fasciclina-like arabinogalactan ( FLA) 9, sintase celulose (CESA) 10, célula domínio NAC associada a parede secundária (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 e realmente proteína interessante novo gene (ANEL) H2 13. Estes estudos foram realizados no secundário caules de plantas de álamo e de eucalipto e fornecidos insights sobre a morfologia das células, química da parede celular e expressão gênica.
Os protocolos descritos aqui têm a intenção de reunir a experiência de umnd conhecimento adquirido através do desenvolvimento e aplicação de ISSA de uma série de estudos publicados e não publicados durante a última década. Eles se concentram na transformação in vivo de tecidos secundária da haste 6 e concentrar-se em estudos envolvendo clone Populus alba 'pyramidalis', Eucalyptus globulus, bem como 11 Eucalyptus camaldulensis clones globulus x. Este documento leva pesquisadores através do protocolo a partir do cultivo de plantas e bactérias, a transformação de tecidos do caule, crescimento e colheita de tecido, de identificação das células transgénicas e tecidos, de preparação para as avaliações fenotípicas e métodos para a recolha e análise de dados. Embora as técnicas de sucesso têm sido aplicados para medir a composição monosaccharide parede celular também 9,11, devido a limitações de espaço, este documento concentra-se em técnicas utilizadas para medir celular e morfologia do tecido e compreender os padrões de expressão de genes em r secundárioems somente. Assim, o protocolo como descrito é ideal para quem procura obter mais insights sobre o papel e / ou expressão de genes ligados ao secundário hastes usando um baixo custo, tecnicamente fácil, e médio e método de alto rendimento.
O protocolo ISSA é um método relativamente simples e eficiente para a criação de tecidos estaminais transgénicas em espécies de árvores, no espaço de alguns meses por análise de genes e promotores de interesse envolvido na madeira e haste formação. Pouco de esforço, além de manter as plantas vivas, é necessária a crescer tecido do caule transgênica após a inoculação, que está em contraste com métodos in vitro em que é necessária extensa cultura de manter tecido ou plantas, onde a produç?…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge funding support for aspect of the work through Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) and LP0211919 (GB) and industry partners Sappi and Mondi as well as Australian Postgraduate Award (EM) from the Australian Research Council and the Young Innovators and Scientist Award through the Australian Department of Agriculture (LT). We also like to thank the Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan and Simon Southerton for the many discussions and ideas they put forward during the development of this protocol and to Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel and Noemie Defaix for assistance in laboratory related work.
Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
Scalpel blade no 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order – http://www.x-gluc.com/index.html | |
Potassium Ferricyanide (III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
Potassium Ferrocyanide (II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
Image J imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |