Ahşap Formasyonu ve İkincil Kök Gelişimi ile ilgilendim Genler ve Promoters incelenmesi için Kaynaklı Somatik Sektör Analizi (ISSA) Kullanımı
Summary
Here we present a protocol that facilitates the medium to high throughput functional characterization of gene and promoter constructs in tree secondary stem tissue within comparatively short time frames. It is efficient, easy to use and widely applicable to a range of tree species.
Abstract
Ağaçlarda ikincil kök büyümesi ve buna bağlı ahşap oluşumu, biyolojik ve ticari açılardan hem önemlidir. Ancak, nispeten daha az gelişimlerini yönetir moleküler kontrolü hakkında bilinmektedir. Bunun nedeni genellikle ikincil büyüme süreçlerinin çalışma ile ilişkili fiziksel, kaynak ve zaman sınırlamaları bölümünde yer almaktadır. In vitro bir dizi teknik odunsu ve odunsu olmayan bitki türleri hem de her iki bitki parçası ya da tüm bitki sistemi kapsayan kullanılmıştır. Ancak, ikincil kök büyüme süreçlerinin incelenmesi için kendi uygulanabilirliği konusunda sorular, belirli türlerin ve emek yoğunluğu dinlemezlik yüksek hacimli uygulamalar için orta için genellikle engelleyici bulunmaktadır. İkincil kök gelişimi ve ahşap oluşumu bakarken Ayrıca, soruşturma kapsamında belirli özelliklerin sadece büyümenin birkaç yıl sonra geç bir ağacın ömrü ölçülebilir hale gelebilir. In vivo p bu zorluklar alternatif elerotocols doğrudan bitkinin ikincil kök transgenik somatik doku sektörlerin oluşturulmasını içeren Kaynaklı Somatik Sektör Analizi, adını geliştirilmiştir. Bu protokolün amacı ağaç türlerinin aralığında kullanılabilir geni ve hızlandırıcı fonksiyonel karakterizasyon için transgenik sekonder bitki dokusu yaratmak için, etkili, kolay ve nispeten hızlı bir araç sağlamaktır. Burada sunulan sonuçlar, ikincil ikincil promotör ekspresyonu yanı sıra ağaç türlerinin ve ahşap morfolojik özelliklerin çeşitli kaynaklanıyor transgenik ikincil kök sektörleri kolayca yüksek orta kolaylaştırıcı değerlendirilebilir kaynaklanıyor tüm canlı dokular ve hücre tiplerinde oluşturulabilir göstermektedir verim fonksiyonel karakterizasyonu.
Introduction
Ağaç gezegen biyokütle önemli bir miktarı içerir ve büyük biyolojik, kültürel ve ticari öneme sahiptir kaynaklanmaktadır. İkincil birçok diğer canlılar için kaynak ve barınak sağlayarak yaşam oluşturmak kaynaklanıyor. Onlar yaşamak ve kereste, kağıt hamuru ve kağıt ve diğer ahşap ve odun dışı ürünlerin üretimi için yenilenebilir bir kaynak olarak hareket ekosistemlerin diğer birçok hizmetler sunmak. İkincil kök gelişimi ve daha özel olarak ahşap oluşumu özel hücre tiplerinin gelişimi düzenleyen karmaşık bir moleküler sistem tarafından yönetilir, biyokimyasal hücre duvarlarının bir bileşim ve nasıl doku ve organ oluşturmak üzere düzenlenmiştir. ikincil kök gelişimi ve ahşap oluşumunun moleküler temelini Kesme içinde ve sapları arasında, uzun nesil süreleri, out-geçiş çiftleşme sistemleri, yüksek heterozigotluk, yüksek genetik yük, mevsimsel dinlenme, uzun ahşap ve kök özelliklerinin değişkenliği dahil olmak üzere birçok faktör tarafından şaşırmış olgunSürekli kuruluş dönemleri ve olgun ağaçlar sırf fiziksel boyutu. Sonuç olarak, bitki gelişiminin moleküler kontrolü çoğu diğer yönlerini ayrıntılı bilgiye ikincil kök gelişimi akrabası anlayışı, henüz emekleme aşamasında olduğunu.
In vitro bir dizi teknik çalışma ve özellikle ahşap ve ikincil hücre çeperi oluşumu, ikincil kök gelişimini anlamak için kullanılmıştır. Bu protokoller, transgenik bitkiler, ya oluşturulur ya da belirli ikincil hücreler ya da doku, ahşap ve / veya ikincil kök gelişimi 1 spesifik yönlerini çalışma için dönüştürülen tüm bitki ya da bitki parçası sistemlerinin kullanılmasını içerir. Transgenik bitkiler bitki dokularında ve hücre tiplerinin çeşitli sonrası genetik dönüşümü telafi edilebilir, ancak ilerleme yavaş, özellikle nedeniyle uzun rejenerasyon için ahşap lif özelliklerinin analiz edilmesi ve (yaş sırasına göre) olgunlaşma süreleri kök zaman, yüksek teknik ve emek demands, düşük aday genlerin verim yanı sıra bazı odunsu bitki türleri yayma zorluklar. Benzer teknikler başarıyla bu sınırlamalar bazılarının üstesinden gelmek Arabidopsis olmayan odunsu model sistemde geliştirilmiştir, fakat bu bir hediye değil tüm orta kök hücre tipleri sapları ve mevsimsel ya da uzun ömür ile ilgili özellikler bu türler 2 okudu edilemez. Alternatif olarak, pinu s radiata kallus kültürleri 3 gibi bitki parçası sistemleri, ilgili zaman dilimleri azaltır. Bu yöntemler ancak bireysel bir hücre tipi çalışmaya kısıtlı ve in vitro deneylerde belirtildiği gibi benzer kısıtlamalar acı vardır. Benzer şekilde, bütün kök eksplantlar içeren apikal kök kültürleri 4 söz göstermiştir ancak henüz spesifik genlerin veya ilgi ortakların çalışma için uygulanmamıştır. Daha yakın zamanda, saçak kök kültürleri içeren alternatif bir protokol eucalypts için geliştirilmiştir ve başarılı olmuştursapları ve tek ağaç türleri sınırlıdır tarihinden en az 5, bununla birlikte, bu yöntem, halen nitro ekimi gerektirir uygulanan çok ikincil kökler içerir.
Burada anlatıldığı gibi uyarılan somatik sektör analizi (ISSA), odun oluşumu ve ikincil kök doku gelişiminde şüpheli rollerle genler ve rehberleri için yüksek verimlilik fonksiyonel bir tarama aracı bir ortam sağlayarak bu sorunların bazılarının üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. ISSA emek aşılır iken, dokunulmamış sekonder gövde transjenik hücrelerin ve dokuların üretilmesi için gerekli süreyi azaltmak için geliştirilmiş bir in vivo dönüşüm ve eleme sistemi, rutin teknik ve verimlilik sınırlamaları vitro yöntemler kullanılır. İkinci g olmayan ağaç türleri ve ilgi konusu dokuda, kısa bir zaman süresi içinde gövde burada tarif edilen protokoller, bağımsız olarak dönüştürülmüş doku sektör ve hücrelerden yüzlerce aynı anda oluşturulması için izinNispeten kısa zaman dilimlerinde ve düşük işgücü maliyeti içindeki enetic ve / veya çevresel varyasyon. ISSA in vivo teknikleri ilk ve kambiyal farklılaşmasında rol oynayan gen ve / veya ortakların çalışmaları ile ikincil kök dokusunda rafine edilmiş bu yana ikincil kök 6 ve tomurcuk 7 dokular için tarif ve var edilmiştir şunlardır: tubulin (TUB) 8, fasciclin benzeri arabinogalaktan ( FLA) 9, selüloz sentaz (CESA) 10, ikincil hücre duvarı ilişkili nac alanı (SND2) 11, ARBORKNOX (ark1) 12 ve gerçekten ilginç yeni gen (HALKA) H2 proteini 13. İkincil yapılmıştır Bu çalışmalar kavak ve okaliptüs bitki ve hücre morfolojisi, hücre duvarı kimyası ve gen ifadesi içine sağlanan anlayışlar kaynaklanıyor.
Burada anlatılan protokoller deneyim a bir araya getirmek için tasarlanmıştırnd bilgi son on yılda yayınlanmış ve yayınlanmamış çalışmaların bir dizi ISSA geliştirilmesi ve uygulanması yoluyla kazandı. Onlar ikincil kök dokularında 6 in vivo dönüşümü odaklanmak ve Ak Kavak 'Pyramidalis' klon, Okaliptüs Globulus yanı sıra 11 Eucalyptus globulus x camaldulensis klonlar içeren çalışmalar üzerinde yoğunlaşmaktadır. Bu belge bitki ve bakteri, kök dokuları, büyüme ve doku hasat, transgenik hücrelerin ve dokuların belirlenmesi, veri toplama ve analizi için fenotipik değerlendirmeler ve yöntemler için hazırlık dönüşümün ekimi protokol ile araştırmacılar alır. Teknikleri başarıyla nedeniyle uzay sınırlamaları, aynı zamanda 9,11 hücre duvarı monosakkarit kompozisyona ölçmek için uygulanan olsa da, bu belge ikincil st gen ekspresyonu hücre ve doku morfolojisi ölçmek ve anlamak için kullanılan teknikler üzerinde yoğunlaşmaktadırems sadece. Buna göre, belirtilen protokol yüksek verimli yöntemi düşük maliyetli, teknik olarak kolay ve orta kullanarak kaynaklanıyor ikincil bağlantılı genlerin rolü ve / veya ifadeye daha fazla anlayışlar kazanmak isteyenler için uygundur.
Protocol
Representative Results
Discussion
ISSA protokol genler ve ahşap yer alan ilgi rehberleri analizi için birkaç ay uzayda ağaç türlerinin transgenik kök dokuların oluşturulması için nispeten basit ve etkili bir yöntemdir ve oluşumunu kaynaklanıyor. Canlı bitkiler tutmak ötesinde küçük bir çaba, geniş kültür dokusu veya bitki, ağaç üretimi yıla kadar sürebilir başlamak için ya da nerede bir gerçek korumak için gerekli olan in vitro yöntemlerin aksine duruyor inokülasyon aşağıdaki transgenik kök dokusunun büyü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge funding support for aspect of the work through Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) and LP0211919 (GB) and industry partners Sappi and Mondi as well as Australian Postgraduate Award (EM) from the Australian Research Council and the Young Innovators and Scientist Award through the Australian Department of Agriculture (LT). We also like to thank the Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan and Simon Southerton for the many discussions and ideas they put forward during the development of this protocol and to Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel and Noemie Defaix for assistance in laboratory related work.
Materials
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order – http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide (III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide (II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| Image J imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation – benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Hawkins, S., Pilate, G., Duverger, E., Boudet, A., Grima-Pettenati, J., Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
