Yenilenebilir Biyoyakıt ve Biyokimyasal Üretim için bir Sıradışı Maya Genetik Mühendisliği
Summary
We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.
Abstract
Yarrowia lipolytica bir, patojen olmayan dimorfik ve kesinlikle aerobik maya türüdür. kendine özgü fizyolojik özellikleri ve metabolik özellikleri nedeniyle, bu sıradışı maya sadece mantar farklılaşma temel doğası çalışma için iyi bir model değil, aynı zamanda biyokimyasal üretim ve kapsamlı genetik manipülasyonlar gerektiren çeşitli biyoteknolojik uygulamalar için umut verici bir mikrobik bir platformdur. Y'nin Ancak genetik manipülasyonlar lipolytica nedeniyle başta KU70 geni isnat edilebilir verimli ve istikrarlı bir genetik transformasyon sisteminin eksikliği yanı sıra homolog olmayan rekombinasyon çok yüksek oranlarda sınırlı olmuştur. Burada, verimli genetik transformasyonu için ve Y gen silinmesi için kolay ve hızlı bir protokol rapor lipolytica Po1g. Y dışsal DNA etkin transformasyonu için İlk olarak, bir protokol lipolytica Po1g kurulmuştur. Second, hedef genlerin daha silinmesi için geliştirilmiş çift çaprazlama homolog rekombinasyon oranı elde etmek için, KU70 gen 1 kb homoloji silah taşıyan bir bozulma kaset dönüştürerek tarafından silindi. Üçüncü olarak, KU70 geninin silindikten sonra gelişmiş gen silme verimliliğini göstermek için, biz tek tek KU70 nakavt platformu zorlanma aynı prosedürler kullanılarak alkol dehidrogenaz ve alkol oksidaz kodlayan 11 hedef genleri silindi. Kesin homolog rekombinasyon oranı silinmesi için en az% 0.5 önemli bir artış gözlenmiştir Po1g KU70 ö 11 hedef genlerin tek gen silinmesi için% 33 -71% ile Po1g içinde KU70 geninin. higromisin B direnç işareti, CRE / LoxP taşıma sistemi bir replikatif plazmit ve maya nakavt suşlarında seçim marker geni, sonunda targe birden fazla tur kolaylaştırmak için Cre rekombinazın ifadesinin uzaklaştırıldıted genetik manipülasyonlar. Ortaya çıkan tek gen silme mutantlar biyoyakıt ve biyokimyasal üretimde potansiyel uygulamalar var.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, geleneksel olmayan bir maya farklı çevresel koşullar 1,2 değişikliklere yanıt olarak maya ya da misel şeklinde büyüyebilir. Böylece, bu iki şekilli maya mantar farklılaşma, morfolojilerinden ve taksonomi 3,4,5 çalışma için iyi bir model olarak kullanılabilir. Genellikle yaygın olarak organik asitler, polialkoller, aroma maddeleri, emülsiyon yapıcılar ve yüzey aktif maddeler 6,7,8,9 gibi gıda katkı maddelerinin çeşitli üretmek için kullanılan bir kasa (GRAS) maya türleri, olarak kabul edilir. Bu kadar hücre kuru ağırlığının 10% 70, zorunlu bir aerobe ve doğal olarak yüksek miktarlarda lipitleri biriken yeteneğine tanınmış yağlı maya, yani. Ayrıca besinlerin 11,12,13 atık kaynaklarının kalıntıların farklı türde de dahil olmak üzere, büyüme için karbon kaynakları geniş bir yelpazede yararlanabilirler. Bu eşsiz özelliklerin tümü Y. yapmak için çok cazip lipolyticaçeşitli biyoteknolojik uygulamalar.
Y'nin tüm genom sekansı, ancak lipolytica 14,15 yayınlandı, bu sıradışı maya genetik manipülasyon diğer maya türleri daha karmaşıktır. İlk olarak, bu maya türlerinin dönüşümü nedeniyle istikrarlı ve verimli bir genetik transformasyon sisteminin 16,17 olmaması çok daha az etkilidir. Doğal epizomal plazmid sistemi bu maya 18 bulunmuştur İkinci olarak, lineer ekspresyon kasetlerinin zahmetli genomik entegrasyon yaygın ilgili genlerin ekspresyonu için kullanılır. Bu maya doğru homolog rekombinasyon yoluyla verimliliği hedefleyen gen düşüktür ve çoğu entegrasyon olayları homolog olmayan sonunda katılmadan (NHEJ) 19 içinden gelmesi nedeniyle genetik knock-out ve knock-ins Üçüncü nesil sınırlıdır.
Bu çalışmada, Y için optimize edilmiş bir transformasyon protokolü rapor lipolytica </em> kolay, hızlı, verimli ve tekrarlanabilir Po1g suşu. Hassas homolog rekombinasyon frekansını artırmak için, NHEJ yolunun önemli bir enzimi kodlayan KU70 geni silinmiş. Optimize edilmiş dönüşüm protokolü kullanılarak ve 1 kb Y. KU70 geni homoloji bölgeleri kuşatan içeren doğrusal bir nakavt kaset dönüştürerek lipolytica Po1g başarıyla silindi. Bu gen silinmesi metodoloji sağlamlığı daha sonra Po1g KU70 Δ suşu alkol dehidrogenaz ve alkol oksidazı genlerini hedef alan ile gösterilmiştir. Bu KU70 delesyon suşu doğal tipte Po1g soyunun daha hedefleme homolog rekombinasyon aracılığıyla gen bir ölçüde daha yüksek bir verimlilik sergilemiş olduğu gözlemlenmiştir. Buna ek olarak, higromisin B direnç taşıyan bir yineleme Cre ifade plazmid işaretleyici kurtarma gerçekleştirmek için inşa edilmiştir. işaretleyici kurtarma th hedef genin birden fazla mermi kolaylaştırırE gen silinmesi Elde edilen mutantlar. Gen silme yanı sıra, burada tarif edilen genetik transformasyonu ve gen silinmesi için protokol özel bir lokus genlerin eklemek için, ve Y alana özgü mutasyonların katılması için uygulanabilir lipolytica genomu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma için Amacımız Y. hedefli gen tırnakları hızlı ve etkin üretimini sağlamaktır Bunu başarmak için lipolytica Po1g suşu. Çeşitli düşünceler ele alınması gerekmektedir. İlk olarak, yüksek bir dönüşüm etkinliği gerekir. Y için Böylece, etkili ve uygun bir kimyasal dönüşümü protokolü lipolytica Po1g suşu Bu çalışmada tanımlanmıştır. PEG-4000 kullanımı, bu soyun başarılı bir transformasyonu için önemli bir faktördür. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz minnetle Singapur (ETRP 1201102) Ulusal Çevre Ajansı finansman desteği kabul, Singapur Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK-CRP5-2009-03), Singapur Bilim, Teknoloji ve Araştırma Ajansı Rekabet Araştırmaları Programı ( 1324004108), Küresel Ar-Ge Proje Programı, Bilgi Ekonomisi Bakanlığı, Kore Cumhuriyeti (N0000677), Savunma Tehdit Azaltma Dairesi (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) ve Sentetik Biyoloji Singapur Ulusal Üniversitesi Girişimi ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 | |
References
- Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M., J, R. u. i. z. -. H. e. r. r. e. r. a. . Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. , 58-66 (2012).
- Coelho, M., Amaral, P., Belo, I., Méndez-Vilas, A. . Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. , 930-940 (2010).
- Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
- Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
- Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
- Domìnguez, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
- Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
- Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
- Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
- Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
- Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
- Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
- Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
- Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
- Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
- Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
- Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
- Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
- Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
- Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
- McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
- Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
- Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).
