Ingeniería genética de un levaduras no convencionales para biocombustible renovable y producción bioquímica
Summary
We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.
Abstract
Yarrowia lipolytica es una especie de levadura no patógena, dimórficos y estrictamente aerobios. Debido a sus características fisiológicas distintivas y características metabólicas, esta levadura no convencional no sólo es un buen modelo para el estudio de la naturaleza fundamental de la diferenciación de hongos pero es también una plataforma microbiana prometedor para la producción bioquímica y diversas aplicaciones biotecnológicas, que requieren extensas manipulaciones genéticas. Sin embargo, las manipulaciones genéticas de Y. lipolytica han sido limitados debido a la falta de un sistema de transformación genética eficiente y estable, así como tasas muy altas de recombinación no homóloga que se puede atribuir principalmente al gen KU70. Aquí, se presenta un protocolo de fácil y rápido para la transformación genética eficiente y para la deleción del gen de Y. lipolytica Po1g. En primer lugar, un protocolo para la transformación eficiente de ADN exógeno en Y. lipolytica Po1g se estableció. Second, para lograr la tasa de recombinación homóloga de doble cruce mejorado para una mayor eliminación de los genes diana, el gen KU70 se eliminó mediante la transformación de una casete de interrupción que lleva 1 brazos kb de homología. En tercer lugar, para demostrar la mayor eficiencia de la supresión de genes después de la supresión del gen KU70, hemos suprimido de forma individual 11 genes diana que codifican la alcohol deshidrogenasa y alcohol oxidasa utilizando los mismos procedimientos en la cepa plataforma nocaut KU70. Se observó que la tasa de recombinación homóloga precisa aumentó sustancialmente de menos de 0,5% para su eliminación del gen KU70 en Po1g al 33% -71% para la sola supresión de genes de los 11 genes diana en Po1g KU70 Δ. Un plásmido de replicación que lleva el marcador de resistencia a higromicina B y el sistema Cre / loxP se construyó, y el gen marcador de selección en las cepas de levadura knockout se eliminó finalmente mediante la expresión de la recombinasa Cre para facilitar múltiples rondas de TargeTED manipulaciones genéticas. Los mutantes de deleción de un solo gen resultantes tienen aplicaciones potenciales en la producción de biocombustibles y bioquímicos.
Introduction
A diferencia de Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, una levadura convencional, puede crecer en forma de levadura o micelio en respuesta a cambios en las condiciones del medio ambiente 1,2. Por lo tanto, esta levadura dimórfica se puede utilizar como un buen modelo para el estudio de la diferenciación de hongos, la morfogénesis y la 3,4,5 taxonomía. Generalmente se considera como una caja fuerte especies de levadura (GRAS), que se utiliza ampliamente para producir una variedad de aditivos de alimentos tales como ácidos orgánicos, polialcoholes, compuestos de aroma, emulsionantes y agentes tensioactivos 6,7,8,9. Es un aerobio obligado y una levadura oleaginosa conocido capaz de acumular naturalmente lípidos en altas cantidades, es decir, hasta el 70% del peso seco de células 10. También se puede utilizar un amplio espectro de fuentes de carbono para el crecimiento, incluyendo diferentes tipos de residuos en los recursos de los residuos como nutrientes 11,12,13. Todas estas características únicas hacen Y. lipolytica muy atractivo paradiversas aplicaciones biotecnológicas.
Aunque toda la secuencia del genoma de la Y. lipolytica ha sido publicada 14,15, la manipulación genética de esta levadura no convencional es más compleja que otras especies de levadura. En primer lugar, la transformación de esta especie de levadura es mucho menos eficiente debido a la ausencia de un sistema de 16,17 transformación genética estable y eficiente. En segundo lugar, la integración genómica laborioso de casetes de expresión lineales se utiliza comúnmente para la expresión de genes de interés ya que ningún sistema plásmido episomal natural se ha encontrado en esta levadura 18. En tercer lugar, la generación de genéticos knock-outs y knock-ins están limitados debido a que el gen de la eficiencia de la focalización mediante recombinación homóloga precisa en esta levadura es baja y la mayoría de los eventos de integración se produce a través de extremos no homólogos (NHEJ) 19.
En este estudio, se presenta un protocolo de transformación optimizada para la Y. lipolytica </em> Po1g cepa, que es fácil, rápido, eficiente y reproducible. Para mejorar la frecuencia de recombinación homóloga precisa, hemos suprimido el gen KU70, que codifica una enzima clave en la vía NHEJ. Al utilizar el protocolo de transformación optimizada y la transformación de un casete nocaut lineal que contiene regiones de homología flanqueantes de 1 kb, el gen de la KU70 Y. lipolytica Po1g se ha eliminado correctamente. La robustez de esta metodología de supresión de genes se demostró posteriormente por la orientación de la alcohol deshidrogenasa y los genes de alcohol oxidasa en la cepa Po1g KU70 Δ. Se observó que la supresión cepa KU70 exhibió una considerablemente mayor eficiencia de la recombinación de genes mediada homóloga de orientación que la de la cepa de tipo salvaje Po1g. Además, un plásmido replicativo expresión Cre que lleva el marcador de resistencia a higromicina B fue construido para llevar a cabo rescate de marcador. El rescate de marcador facilita múltiples rondas de mutagénesis dirigida en THe obtuvo supresión de genes mutantes. Además de la supresión de genes, nuestro protocolo para la transformación genética y la deleción del gen descrito aquí se puede aplicar para insertar genes a loci específicos, y para introducir mutaciones específicas de sitio en el Y. lipolytica genoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestro objetivo para este estudio es permitir la generación rápida y eficiente de los knockouts de genes dirigidos en el Y. lipolytica cepa Po1g. Varias consideraciones deben ser abordados para lograr esto. En primer lugar, se requiere una alta eficacia de transformación. Por lo tanto, un protocolo de transformación química eficiente y conveniente para el Y. cepa lipolytica Po1g se describió en este estudio. El uso de PEG-4000 es un factor crítico para la transformación exito…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo financiero de la Agencia Nacional de Medio Ambiente de Singapur (ETRP 1.201.102), el Programa de Investigación Competitiva de la Fundación Nacional de Investigación de Singapur (NRF-CRP5-2009-03), la Agencia para la Ciencia, Tecnología e Investigación de Singapur ( 1324004108), Global I + D Programa de Proyectos, el Ministerio de Economía del conocimiento, la República de Corea (N0000677), la Agencia de Reducción de Amenazas a la Defensa (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) y la Iniciativa de la biología sintética de la Universidad Nacional de Singapur ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 | |
References
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