Genetic Engineering eines Unconventional Hefe für Erneuerbare Biokraftstoff- und Biochemie Produktion
Summary
We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.
Abstract
Yarrowia lipolytica ist ein nicht-pathogen, dimorphic und streng aeroben Hefe – Arten. Aufgrund seiner besonderen physiologischen Eigenschaften und metabolischen Eigenschaften, diese unkonventionelle Hefe ist nicht nur ein gutes Modell für die Untersuchung der grundlegenden Natur der Pilz-Differenzierung, sondern auch eine vielversprechende mikrobielle Plattform für biochemische Produktion und verschiedene biotechnologische Anwendungen, die umfangreiche genetische Manipulationen erfordern. Allerdings genetische Manipulationen von Y. lipolytica sind begrenzt aufgrund des Fehlens einer effizienten und stabilen genetischen Transformationssystems sowie sehr hohe Raten von nicht-homologe Rekombination , die vor allem auf die KU70 – Gen zugeschrieben werden. Hier berichten wir über ein einfaches und schnelles Protokoll für die effiziente genetische Transformation und für die Gen – Deletion in Y. lipolytica Po1g. Zuerst wird ein Protokoll für die effiziente Transformation von exogener DNA in Y. lipolytica Po1g gegründet wurde. Second, die verbesserte Doppel-crossover homologe Rekombinationsrate für weitere Deletion von Zielgenen zu erreichen, wurde das KU70 – Gens durch Transformieren einer Unterbrechungskassette tragenden 1 kb Homologiearme gelöscht. Drittens die verstärkte Gen – Deletion Effizienz nach dem Löschen des KU70 – Gens zu zeigen, löschten wir einzeln 11 Zielgene kodieren , Alkoholdehydrogenase und Alkohol – Oxidase die gleichen Verfahren auf der KU70 – Knockout – Plattform Stamm verwenden. Es wurde beobachtet, dass die Rate der präzisen homologe Rekombination im wesentlichen von weniger als 0,5% für die Löschung erhöht des KU70 – Gens in Po1g auf 33% -71% für das einzelne Gen – Deletion der 11 Zielgene in Po1g KU70 Δ. Eine replikative Plasmid, das das Hygromycin B-Resistenzmarker und das Cre / loxP-Systems trug konstruiert, und das Selektionsmarker-Gen in der Hefe knockout Stämme wurde schließlich durch die Expression von Cre-Rekombinase entfernt, um mehrere Runden targe erleichternted genetische Manipulationen. Die sich daraus ergebenden Einzel Gen-Deletionsmutanten haben potentielle Anwendungen in der Biokraftstoff- und Biochemie Produktion.
Introduction
Im Gegensatz zu Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, eine unkonventionelle Hefe kann in Form von Hefe oder Mycel in Reaktion auf Änderungen der Umgebungsbedingungen 1,2 wachsen. Somit ist diese dimorphic Hefe kann für die Untersuchung der Pilzdifferenzierung, Morphogenese und Taxonomie 3,4,5 als gutes Modell verwendet werden. Es wird allgemein als sicher (GRAS) Hefearten angesehen, die allgemein verwendet wird , eine Vielzahl von Lebensmittelzusatzstoffen, wie organische Säuren zu produzieren, Polyalkoholen, Aromastoffen, Emulgatoren und oberflächenaktive Mittel 6,7,8,9. Es ist ein obligat aerob und eine bekannte ölige Hefe fähig ist natürlich Lipide bei hohen Mengen, dh bis zu 70% des Zelltrockengewicht 10 ansammeln. Es kann auch ein breites Spektrum von Kohlenstoffquellen für das Wachstum, einschließlich verschiedener Arten von Rückständen in Abfallressourcen als Nährstoffe 11,12,13 nutzen. All diese einzigartigen Eigenschaften machen Y. lipolytica sehr attraktiv fürverschiedene biotechnologische Anwendungen.
Obwohl die gesamte Genomsequenz des Y. lipolytica hat 14,15, genetische Manipulation dieser unkonventionellen Hefe veröffentlicht worden ist komplexer als andere Hefearten. Erstens Transformation dieser Hefearten ist viel weniger effizient aufgrund des Fehlens eines stabilen und effizienten genetischen Transformationssystem 16,17. Zweitens mühselige genomische Integration von linearen Expressionskassetten für die Expression von Genen von Interesse allgemein verwendet , da kein natürlicher episomal Plasmid System in dieser Hefe 18 gefunden. Drittens Generation von genetischen Knock-Outs und Knock-Ins begrenzt, da das Gen Effizienz durch genaue homologe Rekombination in dieser Hefe – Targeting ist gering , und die meisten Integrationsereignisse auftreten , durch nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) 19.
In dieser Studie berichten wir einen optimierten Transformationsprotokoll für die Y. lipolytica </em> Po1g Stamm, der einfach, schnell, effizient und reproduzierbar ist. Um die Frequenz von präzisen homologe Rekombination steigern, wir löschte das KU70 – Gen, das ein Schlüsselenzym in dem NHEJ Stoffwechselweg kodiert. Durch die optimierte Transformationsprotokoll verwendet und eine lineare Knockout – Kassette transformiert enthält flankierenden Homologiebereiche von 1 kb, das KU70 Gen des Y. lipolytica Po1g wurde erfolgreich gelöscht. Die Robustheit dieser Gen – Deletion Methodik wurde dann durch gezielte Alkoholdehydrogenase und Alkohol – Oxidase – Gene in der Po1g KU70 Δ Stamm demonstriert. Es wurde beobachtet , dass die KU70 Deletionsstamms eine wesentlich höhere Effizienz der homologen Rekombination vermittelten Gen zeigten Targeting als die des Wildtyp – Po1g Stamm. Zusätzlich wurde eine replikative Cre Expressionsplasmid den Hygromycin B-Resistenzmarker trägt, konstruiert marker rescue auszuführen. Die Markerrettung erleichtert mehrere Runden von Gen in th Targetinge Gen-Deletionsmutanten erhalten. Neben Gen – Deletion, unser Protokoll für die genetische Transformation und Gen – Deletion hier beschrieben sind, können auf Gene auf bestimmte Loci einfügen angewendet werden, und die ortsspezifische Mutationen in den Y. einführen lipolytica – Genoms.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unser Ziel für diese Studie ist eine schnelle und effiziente Erzeugung von gezielten Gen-Knockout in der Y zu ermöglichen lipolytica Po1g Stamm. Mehrere Überlegungen müssen angegangen werden , um dies zu erreichen. Zunächst wird eine hohe Transformationseffizienz erforderlich. Somit ist eine effiziente und bequeme chemischen Transformationsprotokoll für die Y. lipolytica Po1g Stamm wurde in dieser Studie beschrieben. Die Verwendung von PEG-4000 ist ein kritischer Faktor für die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken für die finanzielle Unterstützung von der Nationalen Umweltagentur von Singapur (ETRP 1.201.102), die Competitive Research Program der National Research Foundation of Singapore (NRF-CRP5-2009-03), der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung von Singapur ( 1324004108), globale F & E-Projekt Programm, das Ministerium für Wissensökonomie, der Republik Korea (N0000677), die Defense Threat Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) und der synthetischen Biologie Initiative der National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 | |
References
- Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M., J, R. u. i. z. -. H. e. r. r. e. r. a. . Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. , 58-66 (2012).
- Coelho, M., Amaral, P., Belo, I., Méndez-Vilas, A. . Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. , 930-940 (2010).
- Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790 (2013).
- Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
- Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
- Domìnguez, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
- Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
- Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
- Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
- Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
- Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
- Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
- Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
- Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
- Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
- Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
- Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
- Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
- Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
- Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
- McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
- Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
- Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).
