Ingegneria genetica di un lievito non convenzionale per i biocarburanti rinnovabili e produzione biochimica
Summary
We herein report methods on the molecular genetic manipulation of the Yarrowia lipolytica Po1g strain for improved gene deletion efficiency. The resulting engineered Y. lipolytica strains have potential applications in biofuel and biochemical production.
Abstract
Yarrowia lipolytica è una specie di lieviti non patogeni, dimorfe e rigorosamente aerobici. Grazie alle sue caratteristiche fisiologiche distintive e caratteristiche metaboliche, questo lievito non convenzionale non è solo un buon modello per lo studio della natura fondamentale di differenziazione fungina, ma è anche una piattaforma microbica promettente per la produzione biochimica e varie applicazioni biotecnologiche, che richiedono ampie manipolazioni genetiche. Tuttavia, le manipolazioni genetiche di Y. lipolytica stato limitato a causa della mancanza di un sistema di trasformazione genetica efficiente e stabile, così come molto elevati tassi di ricombinazione non omologa che può essere attribuito principalmente al gene KU70. Qui riportiamo un protocollo semplice e rapido per la trasformazione genetica efficiente e per delezione di un gene in Y. lipolytica Po1g. Innanzitutto, un protocollo per la trasformazione efficiente di DNA esogeno in Y. lipolytica Po1g è stato stabilito. secoND, per ottenere il doppio attraversamento tasso di ricombinazione omologa migliorato per l'ulteriore eliminazione di geni bersaglio, il gene KU70 stato eliminato trasformando una cassetta perturbazione che trasporta 1 braccia kb di omologia. In terzo luogo, per dimostrare il gene maggiore efficienza l'eliminazione dopo la cancellazione del gene KU70, abbiamo eliminato singolarmente 11 geni bersaglio che codificano alcol deidrogenasi e alcool ossidasi con le stesse modalità del ceppo piattaforma di eliminazione diretta KU70. È stato osservato che il tasso di preciso ricombinazione omologa notevolmente aumentato da meno del 0,5% per l'eliminazione del gene KU70 in Po1g al 33% -71% per il singolo gene cancellazione dei 11 geni bersaglio in Po1g KU70 Δ. Un plasmide replicativo portando il marcatore di resistenza igromicina B e il sistema Cre / loxP è stato costruito, e il gene marcatore di selezione dei ceppi di lievito knockout finalmente è stato rimosso con espressione di Cre ricombinasi per facilitare vari cicli di targeted manipolazioni genetiche. I risultanti singolo gene mutanti di delezione hanno potenziali applicazioni in biocarburanti e produzione biochimica.
Introduction
A differenza di Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, un lievito non convenzionale, può crescere in forma di lievito o micelio in risposta ai cambiamenti delle condizioni ambientali 1,2. Così, questo lievito dimorphic può essere usato come un buon modello per lo studio della differenziazione fungine, morfogenesi e tassonomia 3,4,5. E 'generalmente considerato come una specie di lievito sicuri (GRAS), che è ampiamente utilizzato per produrre una varietà di additivi alimentari, come acidi organici, polialcoli, composti aromatici, emulsionanti e tensioattivi 6,7,8,9. È un aerobio obbligato e un lievito oleaginosa noto in grado di accumulare naturalmente lipidi in quantità elevate, cioè, fino al 70% del peso secco cellulare 10. Si può anche utilizzare una vasta gamma di fonti di carbonio per la crescita, compresi i diversi tipi di residui nelle risorse usati come sostanze nutrienti 11,12,13. Tutte queste caratteristiche uniche fanno Y. lipolytica molto attraente pervarie applicazioni biotecnologiche.
Nonostante l'intera sequenza del genoma del Y. lipolytica è stato pubblicato 14,15, manipolazione genetica di questo lievito non convenzionale è più complessa di altre specie di lievito. In primo luogo, la trasformazione di questa specie di lievito è molto meno efficace a causa della mancanza di un sistema 16,17 trasformazione genetica stabile ed efficiente. In secondo luogo, laboriosa integrazione genomica di cassette di espressione lineari è comunemente usato per l'espressione di geni di interesse come nessun sistema plasmide episomiale naturale è stato trovato in questo lievito 18. In terzo luogo, la generazione di genetica knock-out e knock-in sono limitati perché il gene targeting efficienza attraverso accurate ricombinazione omologa in questo lievito è basso e la maggior parte degli eventi di integrazione avviene attraverso non omologhe fine di entrare (NHEJ) 19.
In questo studio, riportiamo un protocollo trasformazione ottimizzato per il Y. lipolytica </em> Po1g ceppo, che è facile, rapido, efficiente e riproducibile. Per migliorare la frequenza di preciso ricombinazione omologa, abbiamo eliminato il gene KU70, che codifica per un enzima chiave nella via di NHEJ. Utilizzando il protocollo trasformazione ottimizzato e trasformando una cassetta knockout lineare contenente regioni fiancheggianti omologia di 1 kb, il gene KU70 della Y. lipolytica Po1g è stato cancellato con successo. La robustezza di questa metodologia gene delezione è stato poi dimostrato di mira alcool deidrogenasi e geni alcol ossidasi nel ceppo Po1g KU70 Δ. È stato osservato che la delezione KU70 ceppo mostrato una notevole maggiore efficienza di ricombinazione genica mediata omologa di targeting quella del ceppo selvatico Po1g. Inoltre, un replicativa Cre plasmide di espressione che trasporta la marcatore di resistenza igromicina B è stato costruito per consentire salvataggio marcatore. Il salvataggio marcatore facilita vari cicli di gene targeting in the ottenuto gene mutanti di delezione. Inoltre gene delezione, il protocollo per la trasformazione genetica e gene delezione qui descritto può essere applicato per inserire geni a loci specifici, e di introdurre mutazioni sito-specifiche in Y. lipolytica genoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro obiettivo per questo studio è quello di consentire la generazione rapida e efficiente del knockout genici mirati in Y. lipolytica ceppo Po1g. Diverse considerazioni devono essere affrontate per raggiungere questo obiettivo. Innanzitutto, è richiesta una elevata efficienza di trasformazione. Così, un efficiente e conveniente protocollo trasformazione chimica per la Y. lipolytica Po1g ceppo è stato descritto in questo studio. L'uso di PEG-4000 è un fattore critico per la trasf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario da parte dell'Agenzia nazionale per l'ambiente di Singapore (ETRP 1.201.102), il competitivo programma di ricerca del National Research Foundation di Singapore (NRF-CRP5-2009-03), l'Agenzia per la Scienza, Tecnologia e Ricerca di Singapore ( 1324004108), globale R & D Programma di progetto, il Ministero della Economia della Conoscenza, la Repubblica di Corea (N0000677), la difesa dalle minacce Reduction Agency (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) e la biologia sintetica Iniziativa della National University of Singapore ( DPRT / 943/09/14).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA oligos | |
| Y. lipolytica strain Po1g | Yeastern Biotech | leucine auxotrophic derivative of the wild-type strain W29 (ATCC 20460) | |
| Vector pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica expression vector |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | For cloning and propagation of plasmids | |
| pGEM-T vector | Promega | A3600 | TA cloning vector |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmid isolation |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System |
Promega | A9282 | Extract DNA fragments from agarose gels and purify PCR products from an amplification reaction |
| The iProof high-fidelity DNA polymerase |
Bio-Rad | 172-5302 | High-fidelity DNA polymerase |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | Restriction enzyme |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | Restriction enzyme |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | Restriction enzyme |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Restriction enzyme |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | Restriction enzyme |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | Restriction enzyme |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | Restriction enzyme |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | Restriction enzyme |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | Restriction enzyme |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | Restriction enzyme |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA polymerase | Bio-Rad | M0267L | |
| Ampicillin | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | Antibiotics |
| Hygromycin B | PAA | P21-014 | Antibiotics |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA ladder |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| Lithium Acetate | Sigma | ||
| Acetic acid | Sigma | ||
| Glass beads (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNAse A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| D-Glucose | 1st Base | BIO-1101 | |
| YNB without amino acids | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Difco LB Broth | BD | 244620 | |
| Difco LB Agar | BD | 244520 | |
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| Water bath | Memmert | WNB 14 | |
| Stationary/Shaking Incubator | Yihder | LM-570RD | |
| Thermo-shaker | Allsheng | MS-100 | |
| Micro centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| Gel imager | GE | Amersham Imager 600 | |
References
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