Engenharia genética de um fermento Unconventional para Renewable Biofuel e Produção Biochemical

Ao contrário de Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, uma levedura convencional, pode crescer sob a forma de levedura ou micélio em resposta a alterações das condições ambientais ^1,2. Assim, esta levedura dimorphic pode ser usado como um bom modelo para o estudo da diferenciação fúngica, a morfogénese e ^3,4,5 taxonomia. É geralmente considerada como uma espécie de levedura seguros (GRAS), que é amplamente utilizado para produzir uma variedade de aditivos alimentares, tais como ácidos orgânicos, poli-álcoois, compostos de aroma, agentes emulsionantes e agentes tensioactivos ^6,7,8,9. É um aeróbio obrigatório e uma levedura oleaginosa bem conhecido capaz de acumular lípidos naturalmente em altas quantidades, isto é, até 70% do peso seco da célula ^10. Também pode utilizar uma vasta gama de fontes de carbono para o crescimento, incluindo diferentes tipos de resíduos nos recursos usados ​​como nutrientes ^11,12,13. Todas estas características únicas fazem Y. lipolytica muito atraente paradiversas aplicações biotecnológicas.

Apesar de toda a sequência do genoma da Y. lipolytica foi publicada ^14,15, manipulação genética desta levedura não convencional é mais complexa do que outras espécies de levedura. Em primeiro lugar, esta transformação de espécies de levedura é muito menos eficiente devido à ausência de um sistema de transformação genética ^16,17 estável e eficiente. Em segundo lugar, a integração genómica laboriosa de cassetes de expressão lineares é normalmente usado para a expressão de genes de interesse que nenhum sistema de plasmídeo epissomal natural foi encontrado nesta levedura ^18. Em terceiro lugar, geração de knock-out genéticos e knock-ins são limitados porque o gene alvo eficiência através de recombinação homóloga precisas neste levedura é baixa ea maioria dos eventos de integração ocorrer até o final não homóloga juntar (NHEJ) ^19.

Neste estudo, nós relatamos um protocolo de transformação otimizada para o Y. lipolytica </em> estirpe Po1g, que é fácil, rápido, eficaz e reprodutível. Para aumentar a frequência de recombinação homóloga preciso, que suprimido o gene Ku70, que codifica uma enzima chave na via NHEJ. Usando o protocolo de transformação optimizado e transformando uma cassete nocaute linear contendo regiões de homologia flanqueadoras de 1 kb, do gene da Ku70 Y. lipolytica Po1g foi excluído com sucesso. A robustez desta metodologia deleção do gene foi então demonstrado pela segmentação álcool desidrogenase e genes de álcool oxidase na estirpe Po1g Ku70 Δ. Observou-se que a estirpe de eliminação Ku70 exibiram uma eficiência consideravelmente mais elevada de genes mediada por recombinação homóloga segmentação do que a da estirpe de tipo selvagem Po1g. Além disso, um plasmídeo de expressão de Cre replicativa que transporta o marcador de resistência à higromicina B foi construída para efectuar recuperação do marcador. A recuperação do marcador facilita várias rodadas de gene alvo in the obtidos os mutantes de deleção do gene. Além deleção do gene, o nosso protocolo para a transformação genética e a deleção do gene aqui descrita pode ser aplicada para inserir genes para loci específicos, e para introduzir mutações específicas do local em Y. genoma lipolytica.