Fiable y de alta eficiencia de extracción de riñón de células inmunes

Activación del sistema inmune se produce en múltiples enfermedades renales y procesos fisiopatológicos ^6,10,11,13. Las posibles áreas de investigación activa abarcan los diversos factores desencadenantes de la activación del sistema inmune, varios tipos de células implicadas, el patrón de citoquinas / quimioquinas en un entorno enfermedad en particular, la modulación de todos los procesos antes mencionados por un medicamento en particular etc. Para ejemplificar, en la isquemia-reperfusión lesión (un modelo para la lesión renal aguda), hay un aumento en las células inmunes o derivadas de médula ósea las células hematopoyéticas o células CD45 ⁺ en unas pocas horas, que se mantiene durante todo el período de la reparación o fibrosis (6 semanas después) ^{5, 12.} Estas células inmunes secretan ambas citocinas y quimiocinas proinflamatorias y antiinflamatorias para orquestar el proceso de reparación de ^5,12. Actualmente, la capacidad de utilizar múltiples fluoróforos simultáneamente para etiquetar las poblaciones de células en una suspensión de células individuales se ha incrementado con el anuncioventilación de flujo moderna citometría de máquinas con cuatro a cinco láseres. Esto ha añadido sustancialmente a la capacidad de discriminar las poblaciones de células en función de su estado funcional ^3,7. Por ejemplo, para etiquetar con precisión un macrófago como F4 / 80 ^bajo CD11b ^{alto alto} CD206 Ly6b ^baja, sería necesario al menos 3 más fluoróforos en el mismo volumen de muestra a la puerta de células vivas, CD45 + (leucocitos) y Ly6G- (neutrófilos) y esto es muy posible con la nueva citómetros de flujo ^3. Sin embargo, los ensayos de aguas abajo para la secreción de citoquinas, la proliferación celular, la citotoxicidad, la activación de macrófagos y la cuantificación de números de varios subconjuntos de linfocitos y monocitos no sólo las necesidades de buena calidad (células vivas, singletes), pero un número adecuado de células.

El sistema inmune en el riñón se compone de dos componentes de adaptación y innatas y múltiples tipos de células ^1,7,13. Por ejemplo, en ratones a los dos niñoneys juntos se dice que contiene 2-17% (28,000-266,000) CD45 ⁺ células de las células inmunes total de riñón aislado (1,4 x 10 ⁶ células) y alrededor de 5-15% (1,400-4,200) de éstas son ^las células CD4 ^{+ 1 , 5,12.} Un pequeño porcentaje (5-15%, 70-630) de estas células CD4 + son FoxP3 + células (Figura 1) ^1. Debido a estas reducciones paso prudente en porcentajes de células, a veces la población celular de interés (en este caso CD45 + CD4 + FoxP3 + células) está representada por un simple ~ 100 células. El pequeño número de CD45 + CD4 + células FoxP3 + hace que sea imperativo que un gran número de células totales son aisladas y las células son de buena calidad para los estudios posteriores, como los ensayos de secreción de citoquinas. Por otra parte, puede ser necesario combinar riñones 2-3 ratones ya que las subpoblaciones no están representados en números suficientemente altas para llevar a cabo ensayos cuantificables. Por lo tanto, el aislamiento fiable y eficaz de las poblaciones de células mononucleares de riñón es deseable con el fin de tachonary el espectro inmunológica asociada con enfermedades renales.

Tradicionalmente, para el aislamiento de células mononucleares de riñón, los investigadores han usado una variedad de digestiones enzimáticas tales como la colagenasa 1A o II incluyendo DNasa 1 ^1,5,12. Es bien sabido que las colagenasas tienen actividad enzimática que varía con los números de lote y por la compañía de fabricación, lo que exige de titulación para la concentración óptima y la duración de la incubación ^4,14,15. Además, la digestión con colagenasa añade tiempo para picar el riñón en trozos pequeños, hace necesario la incubación de las piezas de riñón en un baño caliente (37 ° C) y tiempo adicional para la incubación en EDTA para parar la reacción. Además, menos esterilidad puede conseguirse, por algunos de los procedimientos aguas abajo que necesitan cultivo celular. Más importante aún, dependiendo del investigador y todas las variables implicadas, conduce a la variabilidad en los datos y la interpretación a través de los laboratorios. Recientemente, con ladesarrollo de tejido disruptores / homogeneizadores mecánicos ^16, la etapa de digestión con colagenasa se ​​evita completamente y reemplazado por un simple rotura mecánica de los riñones ^2. En este documento, se demuestra un método simple pero eficiente para el aislamiento de células inmunes del riñón para las extracciones de células inmunes de todos los días. Es importante destacar que esta técnica se puede adaptar a otros tejidos blandos y no fibrosos, tales como el hígado y el cerebro ^16.