Extraction d'efficacité fiable et haute du rein cellules immunitaires

L' activation du système immunitaire se produit dans les maladies rénales et les multiples processus physiopathologiques ^6,10,11,13. Les domaines potentiels de recherche active englobent les différents déclencheurs pour l'activation du système immunitaire, divers types de cellules impliquées, le motif cytokine / chimiokine dans un cadre particulier de la maladie, la modulation de tous les processus mentionnés ci-dessus par un médicament en particulier, etc. Pour illustrer, dans l'ischémie-reperfusion blessure (un modèle pour lésions rénales aiguës), il y a une augmentation dans les cellules immunitaires ou de moelle osseuse provenant des cellules hématopoïétiques ou CD45 ⁺ cellules en quelques heures, qui est soutenue par la période de réparation ou de fibrose (6 semaines plus tard) ^{5, 12.} Ces cellules immunitaires sécrètent les cytokines et les chimiokines pro-inflammatoires et anti-inflammatoires pour orchestrer le processus de réparation ^5,12. Actuellement, la possibilité d'utiliser simultanément plusieurs fluorophores pour étiqueter des populations de cellules dans une suspension cellulaire unique a augmenté avec l'annoncevent d'écoulement moderne cytométrie machines avec quatre à cinq lasers. Ceci a ajouté sensiblement à la capacité de distinguer les populations de cellules en fonction de leur état ​​de fonctionnement ^3,7-. Par exemple, pour marquer avec précision un macrophage comme F4 / 80 ^basses CD11b ^haute Ly6b ^haute CD206 ^bas, au moins 3 autres fluorophores serait nécessaire dans le même volume d'échantillon à la porte pour les cellules vivantes, CD45 + (leucocytes) et Ly6G- (neutrophiles) et cela est tout à fait possible avec la nouvelle débit Cytometers ^3. Cependant, les dosages en aval pour la sécrétion de cytokines, la prolifération cellulaire, la cytotoxicité, l'activation des macrophages et la quantification du nombre de différents sous-ensembles de lymphocytes et de monocytes n'a besoin pas de bonne qualité (cellules vivantes, singulets), mais un nombre suffisant de cellules.

Le système immunitaire dans le rein est constitué de deux composantes adaptatives et innée et plusieurs types de cellules ^1,7,13. Par exemple, chez la souris les deux enfantsNeys sont ensemble rapporté pour contenir 2-17% (28,000-266,000) CD45 ⁺ cellules du rein totale des cellules immunitaires isolées (1,4 x 10 ⁶ cellules) et environ 5-15% (1,400-4,200) de ceux – ci sont des cellules CD4 ^{+ 1 , 5,12.} Un faible pourcentage (5-15%, 70-630) de ces cellules CD4 + sont FoxP3 + cellules (Figure 1) ^1. En raison de ces réductions de pas sages en pourcentage de cellules, parfois la population cellulaire d'intérêt (dans ce cas CD45 + CD4 + Foxp3 + cellules) est représenté par un simple ~ 100 cellules. Le petit nombre de CD45 + CD4 + FoxP3 cellules +, il est impératif qu'un grand nombre de cellules totales sont isolées et les cellules sont de bonne qualité pour des études en aval, tels que des dosages de cytokines de sécrétion. En outre, il peut être nécessaire de combiner les reins 2-3 souris étant donné que les sous-populations ne sont pas représentés en nombre suffisamment élevé pour effectuer des dosages quantifiables. Par conséquent, l'isolement fiable et efficace des populations de cellules rénales mononucléaires est souhaitable afin de goujony le spectre immunologique associé à des maladies du rein.

Traditionnellement, pour l' isolement des cellules rénales mononucléaires, les chercheurs ont utilisé une variété de digestions enzymatiques telles que la collagénase 1A ou II y compris DNase 1 ^1,5,12. Il est bien connu que les collagénases ont une activité enzymatique qui varie en fonction des numéros de lot et par la société de fabrication, ce qui nécessite un titrage de la concentration optimale et la durée d'incubation ^4,14,15. En outre, la digestion avec de la collagénase ajoute du temps pour hacher le rein en petits morceaux, nécessite l'incubation des morceaux de rein dans un (37 ° C), un bain chauffé et du temps supplémentaire pour l'incubation dans de l'EDTA pour arrêter la réaction. En outre, moins la stérilité peut être obtenue par certaines procédures en aval nécessitant une culture cellulaire. Plus important encore, selon l'enquêteur et toutes les variables impliquées, elle conduit à la variabilité des données et l'interprétation dans les laboratoires. Récemment, avec ledéveloppement de tissus mécaniques Perturbateurs / Homogéniéisateurs ^16, l'étape de digestion de la collagénase est complètement évitée et remplacée par une rupture mécanique simple des reins ^2. Ici, nous démontrons une méthode simple et efficace pour l'isolement des cellules immunitaires rénales pour les extractions de cellules immunitaires de tous les jours. Surtout, cette technique peut être adaptée à d' autres tissus mous et non fibreux tels que le foie et le cerveau ^16.