Надежность и высокая эффективность Извлечение почки иммунных клеток

Иммунной активации системы происходит в нескольких заболеваниях почек и патофизиологических процессов ^6,10,11,13. Потенциальные области активного исследования охватывают различные триггеры для активации иммунной системы, различные типы клеток участвуют, шаблон цитокина / хемокина в конкретных условиях заболевания, модуляция всех вышеуказанных процессов, с помощью конкретного препарата и т.д. В качестве примера, в ишемии травмы (модель для острого повреждения почек), происходит увеличение в иммунных клеток или костного мозга происходит кроветворные клетки или CD45 ⁺ клетки в течение нескольких часов, которое поддерживается через период ремонта или фиброза (6 недель спустя) ^{5, 12.} Эти иммунные клетки секретируют как провоспалительные и противовоспалительные цитокины и хемокины , чтобы организовать процесс ремонта ^5,12. В настоящее время возможность использования нескольких флуорофоров одновременно для обозначения популяции клеток в суспензии отдельных клеток увеличилось с объявлениемотдушина современной проточной цитометрии машин с четырех до пяти лазеров. Это , по существу , добавил к способности различать популяции клеток в зависимости от их функционального состояния ^3,7. Например, чтобы точно обозначить макрофаг , как F4 / 80 с ^низким CD11b ^{высокой} Ly6b ^{высокой} CD206 ^{низкой,} по крайней мере , еще 3 флуорофоры будут необходимы в том же объеме выборки для ворот для живых клеток, CD45 + (лейкоциты) и Ly6G- (нейтрофилы) и это очень возможно с новой Flow цитометры ^3. Тем не менее, ниже по течению анализы на секрецию цитокина, пролиферации клеток, цитотоксичность, активацию макрофагов и квантификации числа различных подмножеств лимфоцитов и моноцитов, не только требует хорошего качества (живые клетки, фуфайки), но достаточное количество клеток.

Иммунная система в почках состоит из обоих адаптивных и врожденных компонентов и различные типы клеток ^1,7,13. Например, у мышей два ребенокNeys вместе , как сообщается, содержат 2-17% (28,000-266,000) CD45 ⁺ клеток иммунной клетки почек общий изолированных (1,4 х 10 ⁶ клеток) и около 5-15% (1,400-4,200) из них являются клетки CD4 ^{+ 1 , 5,12.} Небольшой процент (5-15%, 70-630) этих клеток CD4 + являются FOXP3 + клеток (рисунок 1) ^1. В связи с этим шагом мудрых сокращений в процентах клеток, иногда популяции клеток, представляющих интерес (в данном случае CD45 + CD4 + FoxP3 + клетки) представлена ​​простым ~ 100 клеток. Небольшое количество CD45 + CD4 + FOXP3 + клеток делает необходимым, что большое число полных клеток, выделяют и клетки имеют хорошее качество для последующих исследований, таких как анализы секрецию цитокинов. Кроме того, это может быть необходимо, чтобы объединить почки от 2-3 мышей, так как субпопуляции не представлены в достаточно большом количестве для выполнения количественному анализов. Следовательно, надежной и эффективной изоляции популяций почек мононуклеарных клеток желательно, чтобы шпилькау иммунологический спектр, связанный с заболеваниями почек.

Традиционно для выделения мононуклеарных клеток почек, исследователи использовали различные ферментативные пищеварением , таких как коллагеназы 1A или II , включая ДНКазы 1 ^1,5,12. Хорошо известно , что коллагеназы имеют ферментативную активность, изменяющуюся с серийными номерами и компанией производства, что делает необходимым титрование для оптимальной концентрации и продолжительности инкубации ^4,14,15. Кроме того, вываривание коллагеназы добавляет время для фарша почки на мелкие кусочки, вызывает необходимость инкубации кусочков почек в нагретую (37 ° С) ванны и дополнительное время для инкубации в ЭДТА для остановки реакции. Кроме того, менее стерильность может быть достигнуто в течение нескольких последующих процедур, нуждающихся в клеточной культуре. Что еще более важно, в зависимости от исследователя и всех переменных, участвующих, это приводит к изменчивости в данных и интерпретации между лабораториями. В последнее время, сразвитие механических тканей разрушителями / гомогенизаторов ^16, стадия коллагеназы полностью исключается и заменяется простым механическим разрушением почек ^2. Здесь мы покажем простой, но эффективный метод выделения почек иммунных клеток для повседневных извлечений иммунных клеток. Важно отметить, что эта методика может быть адаптирована к другим мягкими и не фиброзной ткани , такие как печень и мозг ^16.