Summary

موثوقة وعالية استخراج كفاءة الكلى الخلايا المناعية

Published: August 19, 2016
doi:

Summary

Techniques that are reliable and efficient for the isolation of kidney immune cells are needed for downstream applications. This requires surface antibody labeling of a small number of kidney immune cells. Herein, we describe a concise method for isolation of kidney immune cells that seemingly achieves this goal.

Abstract

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes. The immune system consists of both adaptive and innate components and multiple cell types. Sometimes, the cell type of interest is present in very low numbers among the large numbers of total cells isolated from the kidney. Hence, reliable and efficient isolation of kidney mononuclear cell populations is important in order to study the immunological problems associated with kidney diseases. Traditionally, tissue isolation of kidney mononuclear cells have been performed via enzymatic digestions using different varieties and strengths of collagenases/DNAses yielding varying numbers of viable immune cells. Recently, with the development of the mechanical tissue disruptors for single cell isolation, the collagenase digestion step is avoided and replaced by a simple mechanical disruption of the kidneys after extraction from the mouse. Herein, we demonstrate a simple yet efficient method for the isolation of kidney mononuclear cells for every day immune cell extractions. We further demonstrate an example of subset analysis of immune cells in the kidney. Importantly, this technique can be adapted to other soft and non-fibrous tissues such as the liver and brain.

Introduction

يحدث تنشيط جهاز المناعة في أمراض الكلى متعددة والعمليات الفيزيولوجية المرضية 6،10،11،13. المجالات المحتملة للأبحاث نشطة تشمل محفزات مختلفة لتنشيط الجهاز المناعي، ومختلف أنواع الخلايا المعنية، ونمط خلوى / chemokine في وضع مرض معين، تعديل من جميع العمليات الآنفة الذكر التي دواء معين وما إلى ذلك مثالا، في نقص التروية ضخه إصابة (نموذج لقصور كلوي حاد)، أن هناك زيادة في الخلايا المناعية أو النخاع العظمي المستمدة الخلايا المكونة للدم أو CD45 + الخلايا في غضون ساعات قليلة، والذي أصيب خلال الفترة من إصلاح أو التليف (بعد 6 أسابيع) 5، 12. هذه الخلايا المناعية تفرز كل من السيتوكينات و chemokines الموالية للالتهابات ومضادة للالتهابات لتنظيم عملية إصلاح 5،12. حاليا، قد زاد من القدرة على استخدام fluorophores متعددة في وقت واحد لتسمية السكان الخلية في تعليق خلية واحدة مع الإعلانتنفيس عن تدفق الحديث الخلوي الأجهزة مع 4-5 الليزر. وقد أضاف هذا إلى حد كبير في القدرة على تمييز السكان الخلية على أساس حالتها التشغيلية 3،7. على سبيل المثال، لتسمية بدقة بلعم منخفضة، ستكون هناك حاجة F4 / 80 منخفضة CD11b عالية Ly6b CD206 ارتفاع لا يقل عن 3 المزيد من fluorophores في حجم العينة نفسه إلى بوابة للخلايا الحية، CD45 + (الكريات البيضاء) وLy6G- (العدلات) و هذا ممكن إلى حد كبير مع أحدث تدفق Cytometers 3. ومع ذلك، فإن المقايسات المصب لإفراز السيتوكينات، تكاثر الخلايا، سمية الخلايا، وتفعيل البلاعم والكمي لأعداد مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا اللمفية وحيدات لا يحتاج فقط نوعية جيدة (خلايا حية، singlets ل) ولكن أعداد كافية من الخلايا.

ويتكون نظام المناعة في الكلى تتكون من كل من مكونات التكيف والفطرية وأنواع خلايا متعددة 1،7،13. على سبيل المثال، في الفئران طفل اثنينneys يتم الإبلاغ معا لاحتواء 2-17٪ (28،000-266،000) CD45 + الخلايا من الخلايا المناعية مجموع الكلى معزولة (1.4 × 10 6 خلايا) وحوالي 5-15٪ (1،400-4،200) هذه هي خلايا CD4 + 1 ، 5،12. وهناك نسبة صغيرة (5-15٪، 70-630) من هذه CD4 + الخلايا FoxP3 + الخلايا (الشكل 1) 1. ونتيجة لهذه التخفيضات خطوة حكيمة في النسب المئوية للخلايا، وأحيانا السكان خلية من الاهتمام (في هذه الحالة CD45 + CD4 + FoxP3 + الخلايا) يمثله مجرد ~ 100 خلية. عدد قليل من CD45 + CD4 + FoxP3 + خلايا يحتم أن عددا كبيرا من مجموع الخلايا يتم عزل والخلايا هي من نوعية جيدة للدراسات المصب مثل المقايسات خلوى إفراز. وعلاوة على ذلك، قد يكون من الضروري الجمع بين الكليتين 2-3 الفئران منذ لا يتم تمثيل مجموعات سكانية فرعية بأعداد كبيرة كافية لتنفيذ فحوصات قياس الكمي. وبالتالي، العزلة موثوقة وفعالة للسكان الخلية وحيدة النواة الكلى أمر مرغوب فيه من أجل عشيقذ الطيف المناعية المرتبطة أمراض الكلى.

تقليديا، لعزل الخلايا وحيدة النواة الكلى، وقد استخدم الباحثون مجموعة متنوعة من الهضم الأنزيمية مثل كولاجيناز 1A أو الثاني بما في ذلك الدناز 1 1،5،12. ومن المعروف جيدا أن collagenases يكون النشاط الأنزيمي أن يختلف مع الأرقام كثيرا، ومن قبل شركة التصنيع، مما استلزم المعايرة للتركيز الأمثل ومدة الحضانة 4،14،15. وبالإضافة إلى ذلك، والهضم مع كولاجيناز يضيف الوقت لتنميق الكلى إلى قطع صغيرة، يتطلب الحضانة من القطع الكلى في (37 درجة مئوية) حمام ساخن وقتا إضافيا للحضانة في EDTA لوقف التفاعل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق أقل العقم لبعض الإجراءات اللاحقة التي تحتاج إلى زراعة الخلايا. الأهم من ذلك، اعتمادا على المحقق وجميع المتغيرات التي تنطوي عليها، فإنه يؤدي إلى التباين في البيانات وتفسيرها عبر المختبرات. في الآونة الأخيرة، معتطوير الميكانيكية الأنسجة اختلال / المجانسة 16، يتم تجنب خطوة كولاجيناز الهضم تماما والاستعاضة عن تعطل ميكانيكية بسيطة الكلى 2. هنا، علينا أن نظهر طريقة كفؤ بسيط لعزل الخلايا المناعية الكلى للاستخدام اليومي استخراج الخلايا المناعية. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب يمكن أن تتكيف مع الأنسجة الرخوة وغير ليفية أخرى مثل الكبد والدماغ 16.

Protocol

تم استعراض جميع الخطوات بروتوكول تنفيذ والموافقة عليها من قبل جامعة ميسوري رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (ACUC). لهذا البروتوكول، وتم استخدام الذكور C57BL / 6 الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 15 أسبوعا على الرغم من الناحية النظرية أي القوارض في أي سن يمكن أن تستخدم في ال?…

Representative Results

يعتمد عدد من اللوحات التي يمكن تشغيلها على عدد من الخلايا المناعية التي يمكن استخلاصها بشكل موثوق من الكلى. هنا، علينا أن نظهر القدرة على تشغيل 2 لوحات، واحدة للالخلايا اللمفاوية التائية واحد لالضامة / الخلايا الجذعية. على لوحة الخلايا اللمفاوية ال?…

Discussion

لقد قدمنا ​​هنا منهجية للحصول على خلايا المناعة من الكلى بطريقة موثوقة وفعالة. تعديل رئيسي إلى الخطوة كولاجيناز الهضم المستخدمة على نطاق واسع (اضطراب الميكانيكية من الأنسجة) يوفر حوالي 30 دقيقة، ويأخذ عزل عدد كبير من الخلايا المناعية قابلة للحياة اقل من ساعتين لمدة …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work is supported by a Research Grant from Dialysis Clinics Inc. and from the University of Missouri Research Board Grant.

Materials

Stomacher 80 Biomaster lab system Seward
Stomacher 80 Classic bags Seward BA6040/STR
Sorvall Legend XFR Centrifuge Thermo Scientific Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Analytical flow cytometer BD LSR-X20 Fortessa
Percoll  Sigma P1644
Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) Gibco, Life Technologies 14190-250
Polypropylene tubes, no cap Becton Dickinson 352002
Fixable Viability Stain BD Biosciences  FVS510,  564406
Anti-CD16/32 (Clone: 93) EBioscience 14-0161
anti-CD45 (clone: 30-F11)  BV421  BD Pharmingen 103133/4
Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC EBioscience 17-5773
Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 Biolegend 135013/4
anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 Biolegend 103031/2
anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 Biolegend 100413/4
anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 Biolegend 100749/50
Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC Biolegend 127605/6
Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 Biolegend 101227/8
Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC Biolegend 123115/6
Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 Biolegend 117335/6
Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 Biolegend 145705/6
Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE Biolegend 137803/4
100 μm filter  Fisher Scientific 22363548
Fisherbrand Tubes 50 ml Fisher Or equivalent equipment 
Fisherbrand Tubes 15 ml Fisher Or equivalent equipment 
Sucrose Fisher chemical S5-3
Transfer pipette fine tip Samco Scientific 232 Or equivalent equipment 
Flow Cytometery Staining Buffer Solution EBioscience 00-4222-26 Or equivalent equipment 
1X RBC Lysis Buffer EBioscience 00-4333-57 Or equivalent equipment 

References

  1. Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
  2. Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
  3. Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
  4. Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
  5. Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
  6. Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
  7. Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
  8. Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
  9. Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
  10. Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
  11. Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
  12. Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
  13. Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
  14. Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
  15. Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
  16. Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).

Play Video

Cite This Article
Nistala, R., Meuth, A., Smith, C., Annayya, A. Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells. J. Vis. Exp. (114), e54368, doi:10.3791/54368 (2016).

View Video