Preparación y aplicaciones de Organotípicos tímico Slice culturas
Summary
Se describe la preparación de rebanadas tímicos que, en combinación con citometría de flujo, pueden ser usados para modelar la selección positiva y negativa de desarrollar células T. Rebanadas tímicos también pueden ser adaptadas para el análisis in situ de la migración de timocitos, la localización, y la señalización a través de inmunofluorescencia y microscopía de dos fotones.
Abstract
Procede la selección tímica en un microambiente tímico único y altamente organizada que resulta en la generación de un repertorio de células T auto-tolerancia funcional. Modelos in vitro para estudiar el compromiso de linaje T y el desarrollo han proporcionado información valiosa sobre este proceso. Sin embargo, estos sistemas carecen del medio tímico tridimensional completa necesaria para el desarrollo de células T y, por lo tanto, son aproximaciones incompletas de la selección tímica in vivo. Algunos de los desafíos relacionados con el desarrollo de las células T de modelado se pueden superar mediante el uso de modelos in situ que proporcionan un microambiente tímico intacta que es totalmente compatible con la selección tímica de células T en desarrollo. Cultivos de cortes organotípicos del timo de complemento a las técnicas in situ. rebanadas del timo preservar la integridad de las regiones corticales y medulares del timo y proporcionar una plataforma para estudiar el desarrollo de los timocitos superpuestas de una etapa de desarrollo definido o endógena de Tcells dentro de un microambiente tímico madura. Dada la capacidad de generar ~ 20 rebanadas por ratón, rebanadas tímicos presentan una ventaja única en términos de escalabilidad para los experimentos de alto rendimiento. Además, la relativa facilidad en la generación de las rebanadas del timo y el potencial para superponer diferentes subconjuntos del timo u otras poblaciones de células de diversos orígenes genéticos aumenta la versatilidad de este método. Aquí se describe un protocolo para la preparación de las rebanadas del timo, el aislamiento y la superposición de los timocitos, y la disociación de las rebanadas del timo para análisis de citometría de flujo. Este sistema también puede adaptarse para estudiar el desarrollo de las células T no convencional, así como visualizar la migración de timocitos, las interacciones de células de timocitos-estromal, y las señales de TCR asociados con la selección tímica por microscopía de dos fotones.
Introduction
Las células T se diferencian a través de una serie de intermedios de desarrollo en el timo durante el cual se encuentran con varios puntos de control que aseguran la generación de un repertorio de células T auto-tolerante funcional 1-3. La selección positiva promueve la supervivencia de los timocitos con receptores de células T (TCR) capaces de reconocer, con baja a moderada afinidad, péptido presentados por moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) sobre las células corticales tímicos epiteliales (CTEC) 2,3. La selección negativa y el desarrollo de células T reguladoras (Treg) contribuyen a la creación de auto-tolerancia a través de la eliminación o la desviación de los timocitos que responden fuertemente a la auto-péptido presentado por MHC de 2,4. Inmaduros CD4 + CD8 + doble positivo (DP) timocitos que expresan TCR que pasan el proceso de selección se diferencian en subpoblaciones de células T maduras, la mayoría de los cuales son MHC de clase I restringidos citotóxicos CD8 +o MHC de clase II restringido células CD4 + helper individuales positivos (SP) T, antes de salir del timo para realizar funciones efectoras en los órganos linfoides secundarios 1-3.
Además de la complejidad de desarrollo de las células T es la migración dinámica y encuentros celulares de desarrollo de los timocitos en toda la red de células estromales 5-9. Estas células estromales desempeñan papeles distintos en el desarrollo de los timocitos y se distribuyen diferencialmente entre las regiones corticales y medulares del timo, donde positiva y selección negativa ocurren 10. Aunque la selección positiva se lleva a cabo principalmente en la corteza, no hay pruebas de que los timocitos DP migran a la médula y siguen requiriendo señales TCR antes de que se diferencian en células T maduras que sugieren que la médula puede proporcionar señales adicionales necesarias para la finalización de la selección positiva y el linaje 11,12 diferenciación. Promover,a pesar de la presencia de células especializadas medulares del timo epiteliales (Mtec) que expresan los antígenos y restringido de tejidos presentes facilitan la eliminación de los timocitos autorreactivos 13,14, una gran proporción de la selección negativa se produce en la corteza en respuesta a la expresión ubicua de auto-péptido presentado por dendríticas células 15,16. Por lo tanto, modelos precisos de desarrollo de las células T deben proporcionar un microambiente tímico altamente organizada, con cortical intacta y las regiones medulares, que facilita la interacción entre timocitos y células del estroma, y admite la migración de timocitos ya que estas células se someten a selección positiva y negativa.
Para complementar ex vivo análisis de los timocitos como medio de estudio de selección positiva y negativa, una serie de in vitro, in situ, y en modelos in vivo de desarrollo de las células T se han desarrollado 17-22. Ha sido muy difícil de recapitularLa selección positiva in vitro, pero de cocultivo de poblaciones de células madre o precursores de células T con las células del estroma que expresan ligando de Notch, en particular OP9-DL1 / 4 células, tiene la capacidad de soportar el compromiso de linaje T y la selección positiva limitada por lo que es un valor incalculable en el modelo in vitro para estudio de desarrollo de las células T 23-25. Las limitaciones de este sistema, sin embargo, incluyen el hecho de que estas células carecen de la maquinaria de procesamiento de péptido único que se encuentra en las células del estroma tímico y el microambiente tímico tridimensional.
Aunque técnicamente más engorroso, in situ y en modelos in vivo de la selección tímica puede superar algunas de las barreras relacionadas con los sistemas in vitro. Cultivos de órganos de timo Reaggregate (RTOC) contienen mezclas de timocitos y células del estroma tímico 18,26,27 definidos. Estos reaggregates de células epiteliales del timo mantienen clase I y II expresión de MHC y pueden soportar development de los dos subconjuntos de células T convencionales, sin embargo, todavía carecen de estructuras definidas cortical y medular. Fetal de cultivo de órganos del timo (FTOC) es un modelo popular de desarrollo de las células T que pueden ser sembró con timocitos a través de la cultura gota colgante de lóbulos tímicos lymphodepleted o por medio de inyección de timocitos en lymphoreplete lóbulos tímicos y apoyar el desarrollo eficiente de CD4 + y CD8 + T las células a través del tiempo en la cultura 18,28-31. Al inicio del cultivo de los lóbulos del timo fetales hay una escasez de mTECs, pero las estructuras corticales y medulares definidos puede desarrollar con el tiempo dependiendo de las condiciones. Una consideración importante es que este modelo puede apoyar preferentemente fetal frente el desarrollo de células T del adulto. Por último, la inyección intratímica de precursores tímicos definidos en ratones adultos es técnicamente difícil pero es evidente que proporciona un entorno para apoyar El desarrollo de células T in vivo. Estos in situ y en modelos in vivo son excelentes hero el desarrollo de células T de estudio y su uso debe considerarse con carácter experimental, por experimento.
Rebanadas del timo, sin embargo, han surgido recientemente como un modelo versátil, complementaria a estudiar la selección tímica in situ con la posibilidad de alojar única, compleja, y los experimentos de rendimiento general más elevados. Rebanadas del timo mantener la integridad de las regiones corticales y medulares y proporcionan un marco de células del estroma que soporta la migración de timocitos durante el desarrollo, así como la selección positiva y negativa eficiente 11,32-39. Subconjuntos de timocitos añadido encima de las rebanadas del timo migran en el tejido y a su nicho microambientales apropiado 34,37. Los timocitos superpuestos se pueden distinguir de células endógenas rebanada del timo a través de marcadores congenic o marcadores fluorescentes y se pueden mantener en cultivo durante varios días. culturas tímico rebanada organotípicos se pueden utilizar para estudiar diversos aspectosde desarrollo de células T, incluyendo la selección tímica, el comportamiento de timocitos (migración y las interacciones celulares), y la localización de timocitos, entre otros. Teniendo en cuenta la capacidad de generar ~ 20 rebanadas del timo por ratón, la escalabilidad de experimentos es generalmente mayor que la otra en modelos in situ de la selección tímica. Aunque la preparación de las rebanadas del timo requiere un equipo especializado, tal como el vibratome, y el tiempo de vida de las rebanadas del timo en cultivo se limita debido a la pérdida de células en el tiempo a través de la muerte celular y la falta de una membrana de encapsulación, rebanadas tímicos proporcionan un excelente modelo para el análisis de la selección tímica de las poblaciones sincronizadas de los timocitos dentro de un microambiente tímico maduro. Aquí se describe la preparación de las rebanadas del timo (inclusión de la cosecha el timo, la incrustación de agarosa de los lóbulos del timo y vibratome seccionamiento del tejido incrustado), el aislamiento y la superposición de los timocitos, y la disociación de las rebanadas del timo para análisis de citometría de flujo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un protocolo para la preparación de las rebanadas del timo y los resultados representativos de selección positiva y negativa eficiente de pre-selección superpuesto MHC de clase timocitos transgénicos TCR restringido-I por citometría de flujo. Este sistema ha sido utilizado con éxito similar para apoyar la selección positiva de las células T CD4 + clase II restringidas por MHC de pre-selección timocitos DP 32, y, en presencia de antígeno de agonista, la selección negativ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Josée Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1<tmMom> #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) and Hôpital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.
Materials
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50080 | Low melting temperature agarose |
| Embedding Mold (Truncated – T12) | Polyciences | 18986 | 22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm |
| Double Edge Prep Blades | Personna | 74-0002 | |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| 0.4 µm Cell Culture Inserts | BD Falcon | 353090 | Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 21600-010 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent | 080-110 | Heat inactivated |
| L-Glutamine, 200mM | Wisent | 609-065-EL | |
| Penicillin/Streptomycin, 100X | Wisent | 450-201-EL | |
| 2-Mercaptoethanol | Alfa Aesar | A15890 | |
| 15 ml Tenbroeck Tissue Grinders | Wheaton | 357426 | |
| Nylon Mesh Filter | Component Supply | U-CMN-255 | |
| Microcentrifuge Tube Sample Pestle | Bel-Art | F19922-0000 | |
| 40 µm Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Forceps Inox Tip | Dumont | RS-5047 | Fine tip curved forceps, size .17 X .10mm |
| Micro Forceps | Dumont | RS-5090 |
References
- Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
- Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen. Immunity. 41, 181-190 (2014).
- Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. Tracking migration during human T cell development. Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).
- Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns. Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).
- Ross, J. O., et al. Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).
- Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance. J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163, 975-987 (2015).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Stritesky, G. L., et al. Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development. Immunology. 100, 405-410 (2000).
- Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. In vitro models of T cell development. Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).
- de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach. Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).
- Lian, Z., et al. Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells. Stem Cells. 15, 430-436 (1997).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).
- Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors. J Exp Med. 163, 1-17 (1986).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).
- Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells. J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. (18), (2008).
- Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro. J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus. J Exp Med. 173, 539-547 (1991).
- Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments. J Exp Med. 155, 617-622 (1982).
- Fairchild, P. J., Austyn, J. M. Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells. Immunology. 85, 292-298 (1995).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).
- Le Borgne, M., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Ueda, Y., et al. Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat Commun. 3, 1098 (2012).
- Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11, e1001566 (2013).
- Halkias, J., et al. Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ. J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).
- Au-Yeung, B. B., et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).
- Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ. Sci Signal. 6, (2013).
- Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry. J Vis Exp. (68), e4269 (2012).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68, 869-877 (1992).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition. Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).
- Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection. J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).
- Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
- Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).
