إعداد وتطبيقات الثقافات عضوي التوتة شريحة
Summary
وصفنا إعداد شرائح الغدة الصعترية التي، جنبا إلى جنب مع التدفق الخلوي، ويمكن استخدامها لنموذج اختيار الإيجابية والسلبية لتطوير خلايا تي. ويمكن أيضا شرائح الغدة الصعترية يمكن تكييفها لفي الموقع تحليل الهجرة خلية توتية، التعريب، وإشارات عبر المناعي واثنين من الفوتون المجهري.
Abstract
وقد وفرت عائدات اختيار الغدة الصعترية في المكروية الغدة الصعترية فريدة وعالية التنظيم مما يؤدي إلى توليد وظيفية، مرجع خلية T-متسامح النفس. في المختبر نماذج لدراسة التزام نسب T والتنمية رؤى قيمة حول هذه العملية. ومع ذلك، فإن هذه النظم تفتقر إلى كامل محيط الغدة الصعترية ثلاثي الأبعاد ضروري للتنمية الخلايا التائية، وبالتالي، هي تقريبية غير مكتملة في الجسم الحي اختيار الغدة الصعترية. بعض التحديات المتعلقة بالتنمية خلية النمذجة تي يمكن التغلب عليها باستخدام النماذج في الموقع التي توفر المكروية الغدة الصعترية سليمة التي تؤيد تأييدا كاملا اختيار الغدة الصعترية من تطوير خلايا تي. الغدة الصعترية الثقافات شريحة عضوي النمط تكمل القائمة في تقنيات الموقع. شرائح الغدة الصعترية الحفاظ على سلامة المناطق القشرية والنخاعية الغدة الصعترية وتوفر منبرا لدراسة تطوير thymocytes مضافين لمرحلة تنموية محددة أو الذاتية T جملتعلمي اللغة اإلنكليزية في المكروية الغدة الصعترية ناضجة. نظرا لقدرتها على توليد ~ 20 شرائح في الماوس، وشرائح الغدة الصعترية تقدم ميزة فريدة من نوعها من حيث قابلية للتجارب إنتاجية عالية. وعلاوة على ذلك، السهولة النسبية في توليد شرائح الغدة الصعترية والقدرة على تراكب فرعية التوتة مختلفة أو السكان الخلية الآخرين من خلفيات وراثية متنوعة تعزز براعة هذا الأسلوب. نحن هنا وصف بروتوكول لإعداد شرائح الغدة الصعترية، والعزلة، وتراكب thymocytes، وتفكك شرائح الغدة الصعترية لتحليل تدفق cytometric. ويمكن أيضا أن تتكيف هذا النظام لدراسة تطوير الخلايا التائية غير التقليدية وكذلك تصور الهجرة خلية توتية، التفاعلات خلية خلية توتية اللحمية، وإشارات TCR المرتبطة اختيار الغدة الصعترية بواسطة المجهر ثنائي الفوتون.
Introduction
خلايا T تفرق من خلال سلسلة من وسيطة التنموية في الغدة الصعترية وهي الفترة التي كانت تواجه عدة نقاط التفتيش التي تضمن توليد وظيفية، متسامح النفس مرجع الخلايا التائية 1-3. اختيار إيجابية تعزز بقاء thymocytes مع مستقبلات الخلايا التائية (TCR) قادرة على الاعتراف، مع انخفاض في تقارب المعتدل، الببتيد التي قدمها الجزيئات الرئيسية في أنسجة الجسم المعقدة (MHC) على الخلايا القشرية الغدة الصعترية الظهارية (CTEC) 2،3. اختيار السلبية وتنمية الخلايا التائية التنظيمية (T ريج) تساهم في إنشاء التسامح مع الذات عن طريق القضاء أو تحويل thymocytes التي تستجيب بقوة لالببتيد الذاتي التي قدمها MHC 2،4. غير ناضجة CD4 + CD8 + إيجابية المزدوج (DP) thymocytes معربا عن TCRs التي تمر عملية اختيار تفرق في القطعان الخلايا التائية الناضجة، والغالبية العظمى منها MHC الصف الأول المقيدة CD8 + السامة للخلاياأو MHC من الدرجة الثانية المقيدة CD4 + المساعد (SP) خلايا إيجابية واحدة T، قبل أن تغادرها الغدة الصعترية لأداء وظائف المستجيب في الأجهزة اللمفاوية الثانوية 1-3.
إضافة إلى تعقيد تطوير الخلايا التائية هي الهجرة ديناميكية واللقاءات الخلوية تطوير thymocytes في جميع أنحاء شبكة خلية انسجة 5-9. هذه الخلايا اللحمية تلعب أدوارا متميزة في تطوير خلية توتية ويتم توزيعها بشكل مختلف بين المناطق القشرية والنخاعية الغدة الصعترية حيث الايجابية والسلبية اختيار تحدث 10. على الرغم من أن اختيار إيجابية تجري في المقام الأول في القشرة، وهناك أدلة تتراكم أن موانئ دبي thymocytes تهاجر إلى النخاع ولا تزال بحاجة إلى إشارات TCR قبل أن تتمايز إلى خلايا T ناضجة مما يشير إلى أن النخاع قد توفر إشارات إضافية ضرورية لاستكمال اختيار الإيجابية ونسب التمايز 11،12. وعلاوة على ذلك،على الرغم من وجود خلايا متخصصة النخاعية الغدة الصعترية الظهارية (MTEC) التي تعبر عن ومولدات المضادات المقيدة الأنسجة موجودة تسهيل حذف thymocytes autoreactive 13،14، تحدث نسبة كبيرة من اختيار السلبية في القشرة ردا على أعرب بتواجد مطلق الببتيد الذاتي قدمت من قبل شجيري الخلايا 15،16. وبالتالي، يجب نماذج دقيقة للتطوير الخلايا التائية توفر المكروية الغدة الصعترية درجة عالية من التنظيم، مع القشرية سليمة والمناطق النخاعية، التي تسهل التفاعل بين thymocytes والخلايا اللحمية، وتدعم الهجرة خلية توتية كما تخضع هذه الخلايا اختيار الإيجابية والسلبية.
لتكمل خارج الحي تحليلات thymocytes كوسيلة لدراسة اختيار الإيجابية والسلبية، وعدد من في المختبر، في الموقع، وفي النماذج الحية للتنمية الخلايا التائية وضعت 17-22. فقد كان من الصعب بمكان أن ألخصاختيار إيجابية في المختبر، ولكن coculture من السكان الخلايا الجذعية أو السلائف الخلايا التائية مع خلايا انسجة التعبير عن الشق يجند، ولا سيما OP9-DL1 / 4 خلايا، لديها القدرة على دعم التزام نسب T واختيار إيجابية محدودة مما يجعله لا يقدر بثمن في نموذج المختبر ل دراسة T نمو الخلايا 23-25. قيود من هذا النظام، ومع ذلك، تشمل حقيقة أن هذه الخلايا تفتقر إلى المعدات اللازمة لتصنيع الببتيد فريدة من نوعها وجدت في خلايا انسجة الغدة الصعترية والمكروية الغدة الصعترية ثلاثية الأبعاد.
وإن كان أكثر تعقيدا من الناحية الفنية، في الموقع والنماذج الحية من اختيار الغدة الصعترية يمكن التغلب على بعض العقبات المتعلقة بنظم في المختبر. Reaggregate الثقافات الجهاز الغدة الصعترية (RTOC) تحتوي على تعريف خليط من thymocytes والخلايا اللحمية الغدة الصعترية 18،26،27. هذه reaggregates الخلايا الظهارية التوتة الحفاظ MHC من الدرجة الأولى والثانية والتعبير يمكن أن تدعم الإنمائية للالإقليم الشمالي على حد سواء التقليدية فرعية الخلايا التائية، ومع ذلك لا تزال تفتقر إلى تعريف المنشآت القشرية والنخاعية. الجنين الثقافة الجهاز الغدة الصعترية (FTOC) هو نموذج شعبية للتنمية الخلايا التائية التي يمكن المصنف مع thymocytes عبر ثقافة شنقا الإفلات من فصوص الغدة الصعترية lymphodepleted أو عن طريق الحقن من thymocytes إلى lymphoreplete فصوص الغدة الصعترية ودعم التنمية الفعالة للCD4 + و CD8 + T الخلايا مع مرور الوقت في الثقافة 18،28-31. في بدء ثقافة فصوص الغدة الصعترية الجنين هناك ندرة في mTECs، ولكن الهياكل القشرية والنخاعية محددة قد تتطور بمرور الوقت اعتمادا على الظروف. وهو عامل مهم هو أن هذا النموذج قد دعم تفضيلي الجنين مقابل تطوير خلية بالغة تي. وأخيرا، حقن intrathymic السلائف التوتة المحددة في فئران بالغة يمثل تحديا تقنيا ولكنها توفر بوضوح بيئة لدعم تطوير خلايا T في الجسم الحي. هذه في الموقع والنماذج الحية هي أدوات ممتازة رo يجب النظر في مسألة التنمية خلية الدراسة تي واستخدامها على أساس التجربة تلو التجربة.
شرائح الغدة الصعترية، ومع ذلك، فقد ظهرت مؤخرا كنموذج تنوعا، مكملة لدراسة اختيار الغدة الصعترية في الموقع مع إمكانية استيعاب فريدة من نوعها، ومعقدة، والتجارب التي مرت أعلى عموما. شرائح الغدة الصعترية الحفاظ على سلامة المناطق القشرية والنخاعية وتوفر إطارا الخلايا اللحمية التي تدعم الهجرة خلية توتية خلال التنمية، فضلا عن كفاءة الإيجابية والسلبية اختيار 11،32-39. مجموعات فرعية خلية توتية أضاف فوق شرائح الغدة الصعترية تهاجر إلى الأنسجة وعلى النحو المناسب microenvironmental المتخصصة 34،37. وthymocytes مضافين يمكن تمييزها عن الخلايا الذاتية شريحة الغدة الصعترية عبر علامات مسانج أو العلامات الفلورية ويمكن حافظت في الثقافة لعدة أيام. الثقافات الغدة الصعترية شريحة عضوي النمط يمكن استخدامها لدراسة الجوانب المختلفةالتنمية الخلايا التائية بما في ذلك اختيار التوتة، والسلوك خلية توتية (الهجرة والتفاعلات الخلوية)، وتوطين خلية توتية، من بين أمور أخرى. نظرا لقدرتها على توليد ~ 20 شرائح الغدة الصعترية في الماوس، وقابلية للتجارب أكبر عموما من غيرها في نماذج الموقع من اختيار الغدة الصعترية. على الرغم من أن إعداد شرائح الغدة الصعترية يتطلب معدات متخصصة، مثل vibratome، والوقت حياة شرائح الغدة الصعترية في الثقافة محدودة بسبب فقدان الخلايا مع مرور الوقت عن طريق موت الخلايا وعدم وجود غشاء تغليف، توفر شرائح الغدة الصعترية نموذجا ممتازا لتحليل اختيار الغدة الصعترية السكان متزامنة من thymocytes ضمن المكروية الغدة الصعترية ناضجة. نحن هنا وصف إعداد شرائح الغدة الصعترية (بما في ذلك حصاد الغدة الصعترية، تضمين الاغاروز من فصوص الغدة الصعترية وvibratome باجتزاء الأنسجة جزءا لا يتجزأ)، والعزلة وتغشية thymocytes، وتفكك شرائح الغدة الصعترية لتحليل تدفق cytometric.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف بروتوكول لإعداد شرائح الغدة الصعترية ونتائج ممثل اختيار الإيجابية والسلبية كفاءة مضافين الاختيار معقد التوافق النسيجي الكبير المقيدة أنا TCR thymocytes المعدلة وراثيا عن طريق التدفق الخلوي. وقد استخدم هذا النظام مع نجاح مماثل لدعم اختيار الإيجابية للMHC من الد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Marilaine Fournier for her comments on the manuscript and Josée Tessier for technical assistance. C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1<tmMom> #4175 were obtained through the NIAID Exchange Program, NIH. Support for this research is provided by a grant from the SickKids Foundation and CIHR-IHDCYN (NI15-002), an operating grant from the CIHR-III (MOP-142254), and start-up funds from the FRQS (Établissement de jeunes chercheurs) and Hôpital Maisonneuve-Rosemont Foundation to HJM. HJM is a junior 1 scholar of the FRQS, a CIHR New Investigator (MSH-141967), and a Cole Foundation Early Career Transition award recipient.
Materials
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | 50080 | Low melting temperature agarose |
| Embedding Mold (Truncated – T12) | Polyciences | 18986 | 22mm x 22mm square, truncated to 12mm x 12mm |
| Double Edge Prep Blades | Personna | 74-0002 | |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | |
| 0.4 µm Cell Culture Inserts | BD Falcon | 353090 | Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 21600-010 | |
| RPMI-1640 with L-glutamine | Wisent | 350-000-CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent | 080-110 | Heat inactivated |
| L-Glutamine, 200mM | Wisent | 609-065-EL | |
| Penicillin/Streptomycin, 100X | Wisent | 450-201-EL | |
| 2-Mercaptoethanol | Alfa Aesar | A15890 | |
| 15 ml Tenbroeck Tissue Grinders | Wheaton | 357426 | |
| Nylon Mesh Filter | Component Supply | U-CMN-255 | |
| Microcentrifuge Tube Sample Pestle | Bel-Art | F19922-0000 | |
| 40 µm Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Forceps Inox Tip | Dumont | RS-5047 | Fine tip curved forceps, size .17 X .10mm |
| Micro Forceps | Dumont | RS-5090 |
References
- Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
- Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen. Immunity. 41, 181-190 (2014).
- Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).
- Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. Tracking migration during human T cell development. Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).
- Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns. Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).
- Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).
- Ross, J. O., et al. Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).
- Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance. J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163, 975-987 (2015).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Stritesky, G. L., et al. Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development. Immunology. 100, 405-410 (2000).
- Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. In vitro models of T cell development. Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).
- de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach. Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).
- Lian, Z., et al. Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells. Stem Cells. 15, 430-436 (1997).
- Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).
- Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors. J Exp Med. 163, 1-17 (1986).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).
- Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells. J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).
- White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. (18), (2008).
- Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro. J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus. J Exp Med. 173, 539-547 (1991).
- Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments. J Exp Med. 155, 617-622 (1982).
- Fairchild, P. J., Austyn, J. M. Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells. Immunology. 85, 292-298 (1995).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).
- Le Borgne, M., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
- Ueda, Y., et al. Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat Commun. 3, 1098 (2012).
- Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11, e1001566 (2013).
- Halkias, J., et al. Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ. J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).
- Au-Yeung, B. B., et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).
- Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ. Sci Signal. 6, (2013).
- Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry. J Vis Exp. (68), e4269 (2012).
- Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68, 869-877 (1992).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition. Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).
- Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection. J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).
- Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
- Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).
