Приготовление и применение Органотипической тимуса срез культуры

Т – клетки дифференцируются через ряд промежуточных развития в тимусе , во время которого они сталкиваются несколько контрольно – пропускных пунктов , которые обеспечивают формирование функциональной, само толерантные Т – клеточного репертуара ^1-3. Положительный отбор способствует выживанию тимоцитов с рецепторами Т – клеток (TCR) , способных распознавать, с низкой до умеренной аффинностью, пептида , представленные главного комплекса гистосовместимости (MHC молекул) на корковых тимуса эпителиальных клеток (CTEC) ^2,3. Отрицательный отбор и развитие клеток регуляторных Т (Т _р) способствовать созданию аутотолерантности через ликвидацию или утечки тимоцитов , которые сильно реагируют на само-пептида , представленного MHC ^2,4. Незрелые CD4 ⁺ CD8 ⁺ двойной положительный (DP) тимоцитов выражения ТКО , которые проходят процесс отбора дифференцируются в зрелые субпопуляции Т – клеток, большинство из которых являются MHC класса I-ограниченный CD8 ⁺ цитотоксическихили МНС класса II с ограничением CD4 ⁺ хелперов одиночных положительных (SP) Т – клетки, перед выходом из тимуса выполнять эффекторные функции во вторичных лимфоидных органах ^1-3.

Добавление к сложности развития Т – клеток является динамическая миграция и клеточные столкновения развивающихся тимоцитов в рамках всей сети стромальных клеток ^5-9. Эти стромальные клетки играют различные роли в развитии тимоцитов и дифференциально распределены между тимуса коркового и мозгового регионов , где положительные и отрицательные отбор происходят ^10. Хотя положительный отбор происходит в основном в коре головного мозга, есть накопление доказательств того, что DP тимоциты мигрируют в костный мозг и продолжают требовать сигналов TCR, прежде чем они дифференцируются в зрелые Т-клетки, предполагающих, что продолговатый может предоставлять дополнительные сигналы, необходимые для завершения положительного отбора и линии дифференциация ^11,12. В дальнейшем,несмотря на наличие специализированных медуллярных тимуса эпителиальных клеток (Mtec) , которые выражают и присутствующих тканей с ограничением антигенов , способствующих удаления аутореактивных тимоцитов ^13,14, большая часть негативной селекции происходит в коре головного мозга в ответ на Повсеместно выражали себя пептид , представленный дендритные клетки ^15,16. Таким образом, точные модели развития Т-клеток должны обеспечивать высокоорганизованной тимуса микросреду, с неповрежденной коркового и мозгового областей, что облегчает взаимодействие между тимоцитов и стромальных клеток, а также поддерживает миграцию тимоцитов, как эти клетки подвергаются позитивной и негативной селекции.

В дополнение к экс виво анализ тимоцитов в качестве средства изучения позитивной и негативной селекции, ряд ин витро, на месте, и в естественных условиях модели развития Т – клеток, были разработаны ^17-22. Это было известно, трудно резюмироватьположительный выбор в пробирке, но сокультивирования популяций стволовых клеток или предшественников Т – клеток с стромальных клеток , экспрессирующих лиганд Notch, в частности OP9-DL1 4 клеток /, имеет возможность поддерживать T коммитирование и ограниченный положительный выбор делает его незаменимым в пробирке модель для исследование развития Т – клеток ^23-25. Ограничения этой системы, однако, включают в себя тот факт, что эти клетки лишены уникальной обработки пептидный машины нашли в вилочковой стромальных клеток и трехмерную тимуса микросреду.

Хотя технически более громоздким, на месте и в естественных условиях модели тимуса отбора могут преодолеть некоторые из барьеров , связанных с системами в пробирке. Перегруппировываться тимуса культуры органов (РИПЦ) содержат определенные смеси тимоцитов и тимуса стромальных клеток ^18,26,27. Эти тимуса эпителиальные reaggregates клеток поддерживать экспрессию класса I и II MHC и может поддерживать developmeнт как обычных подмножеств Т-клеток, но все еще не имеют определенные коркового и мозгового структур. Эмбрионального тимуса органной культуры (FTOC) является популярной моделью развития Т – клеток , которые могут быть посеяны с тимоцитов через висячей капле культуры lymphodepleted тимуса долей или через инъекции тимоцитов в lymphoreplete тимуса долей и поддерживать эффективное развитие CD4 ⁺ и CD8 ⁺ T клетки с течением времени в культуре ^18,28-31. В начала культивирования эмбриональных тимуса долей существует недостаток mTECs, но определенные коркового и мозгового структуры могут развиваться с течением времени в зависимости от условий. Важным моментом является то, что эта модель может преимущественно поддерживать плода по сравнению с развитием взрослых Т-клеток. Наконец, внутритимусной инъекция определенных предшественников тимуса у взрослых мышей является технически сложной задачей, но очевидно, обеспечивает среду для поддержки Развитие Т – клеток в естественных условиях. Они на месте и в естественных условиях модели являются отличными инструментами то развитии исследования Т-клеток и их использование должно рассматриваться на основе эксперимента, по-эксперимента.

Тимуса ломтики, тем не менее, в последнее время появились в качестве универсального, комплементарной модели для исследования тимуса выбор на месте с возможностью размещения уникальной, сложной и в целом выше экспериментов пропускной способности . Тимуса ломтики сохранить целостность коркового и мозгового вещества регионов и обеспечить основу для стромальных клеток , которая поддерживает миграцию тимоцитов в процессе развития, а также эффективной позитивной и негативной селекции ^11,32-39. Тимоцитов подмножества добавлены на вершине тимуса ломтиками мигрируют в ткани и их соответствующей нише микросреды ^34,37. Накладываемого тимоцитов можно отличить от тимуса срезов эндогенных клеток с помощью конгенных маркеров или флуоресцентных меток и может поддерживаться в культуре в течение нескольких дней. Тимуса срез органотипической культуры могут быть использованы для изучения различных аспектовразвития Т-клеток, включая отбор тимуса, поведение тимоцитов (миграция и клеточных взаимодействий), а также локализации тимоцитов, среди других. Учитывая способность генерировать ~ 20 тимуса ломтиков на мышь, масштабируемость экспериментов , как правило , больше , чем другие в моделях натурных тимуса селекции. Хотя подготовка тимуса срезов требует специального оборудования, такого как vibratome, а срок службы тимуса срезов в культуре ограничено из-за потери клеток с течением времени через гибель клеток и отсутствие инкапсулирования мембраны, тимуса срезы обеспечивают отличную модель для анализа тимуса выбора синхронизированных популяций тимоцитов в зрелом тимуса микросреды. Здесь мы опишем приготовление тимуса срезов (включая заготовки тимус, агароза вложение тимуса долей и vibratome секционирования внедренного ткани), выделение и наложение тимоцитов и диссоциации тимуса срезов для анализа проточной цитометрии.