Voorbereiding en Toepassingen van organotypische thymus Slice Culturen

T-cellen differentiëren door een reeks van ontwikkelings tussenproducten in de thymus gedurende welke zij verschillende checkpoints dat het genereren van een functioneel, zelfverdraagzaam T cel repertoire ^1-3 garanderen tegenkomen. Positieve selectie bevordert de overleving van thymocyten met T-cel receptoren (TCR) kunnen herkennen, met een lage tot matige affiniteit, peptide gepresenteerd door major histocompatibility complexe moleculen (MHC) op corticale thymus epitheelcellen (CTEC) ^2,3. Negatieve selectie en regulatoire T (T _reg) ontwikkeling cel bijdragen aan de totstandkoming van zelf-tolerantie via het wegnemen of misbruik van thymocyten die sterk reageren op self-peptide gepresenteerd door MHC ^2,4. Onrijpe CD4 ⁺ CD8 ⁺ dubbel positieve (DP) thymocyten expressie TCRs die het selectieproces overgaan differentiëren in rijpe T-cel subpopulaties, waarvan de meeste zijn MHC klasse I-beperkte CD8 ⁺ cytotoxischeof MHC klasse II beperkte CD4 ⁺ helper enkel positieve (SP) T-cellen, voor het verlaten van de thymus tot effector functies in de secundaire lymfoïde organen ^1-3.

Wat de complexiteit van T cel ontwikkeling is de dynamische migratie en cellulaire ontmoetingen ontwikkelen thymocyten gehele stromale cel netwerk ^5-9. Deze stromale cellen spelen verschillende rollen in thymocyten ontwikkeling en zijn verschillend verdeeld over de thymus corticale en medullaire regio's waar de positieve en negatieve selectie plaatsvinden ^10. Hoewel positieve selectie vindt plaats in de eerste plaats in de cortex, er is een groeiend bewijs dat DP thymocyten migreren naar het merg en blijven TCR signalen voordat ze differentiëren in mature T-cellen suggereert dat het merg extra signalen kunnen verschaffen die nodig zijn voor de voltooiing van positieve selectie en lineage differentiatie ^11,12. Verder,ondanks de aanwezigheid van gespecialiseerde medullaire thymus epitheelcellen (MTES) die expressie en huidige weefsel beperkte antigenen vergemakkelijken deletie van autoreactieve thymocyten ^13,14, een groot deel van de negatieve selectie plaatsvindt in de cortex in reactie op alomtegenwoordig tot expressie zelf peptide door dendritische cellen ^15,16. Zo moet nauwkeurige modellen van T-cel ontwikkeling een zeer georganiseerde thymus micromilieu te voorzien, met intacte corticale en medullaire regio's, dat de interactie tussen thymocyten en stromale cellen faciliteert en ondersteunt thymocyt migratie deze cellen ondergaan positieve en negatieve selectie.

Als aanvulling ex vivo analyse van thymocyten als middel bestuderen positieve en negatieve selectie, een aantal in vitro, in situ en in vivo modellen van T cel ontwikkeling ontwikkeld ^17-22. Het is altijd moeilijk recapitulerenpositieve selectie in vitro, maar co-cultuur van stamcelpopulaties of T cel voorlopers met stromale cellen die Notch-ligand, met name OP9-DL1 / 4 cellen, heeft de mogelijkheid om T lineage inzet en beperkte positieve selectie ondersteunen waardoor het een waardevol in vitro model studie T cel ontwikkeling ^23-25. Beperkingen van dit systeem omvatten echter het feit dat deze cellen het unieke peptide machines gevonden in thymus stromale cellen en de driedimensionale thymus micromilieu.

Hoewel technisch omslachtig, in situ en in vivo modellen van thymus selectie enkele obstakels met betrekking tot in vitro systemen te overwinnen. Reaggregate thymus orgel culturen (RTOC) bevatten gedefinieerde mengsels van thymocyten en thymus stromale cellen ^18,26,27. Deze thymus epitheelcellen reaggregates behouden MHC klasse I en II expressie en kan Developme ondersteunennt van zowel conventionele T-cel subsets, maar nog steeds niet gedefinieerd corticale en medullaire structuren. Foetale thymus orgaankweek (FTOC) is een populair model T cel ontwikkeling die met thymocyten via hangende-druppel cultuur lymphodepleted thymus lobben of via injectie van thymocyten kan worden gezaaid in lymphoreplete thymus lobben en ondersteunen efficiënte ontwikkeling van CD4 ⁺ en CD8 ⁺ T cellen na verloop van tijd in cultuur ^18,28-31. Aan het begin van de cultuur van de foetale thymus lobben is er een gebrek aan mTECs, maar gedefinieerd corticale en medullaire structuren kunnen ontwikkelen in de tijd afhankelijk van de omstandigheden. Een belangrijke overweging is dat dit model voorkeur kan ondersteunen foetale versus volwassen T cel ontwikkeling. Tenslotte intrathymic injectie van gedefinieerde thymus voorlopers in volwassen muizen is technisch uitdagend, maar geeft duidelijk een omgeving te steunen T cel ontwikkeling in vivo. Deze in situ en in vivo modellen zijn uitstekende hulpmiddelen to studie T cel ontwikkeling en het gebruik ervan moet worden beschouwd als een experiment-by-experiment basis.

Thymus segmenten hebben echter onlangs ontwikkeld tot een veelzijdige complementair model thymus de selectie in situ met de mogelijkheid om unieke, complexe en algemeen hogere throughput experimenten tegemoet. Thymus plakjes handhaven van de integriteit van de corticale en medullaire regio's en bieden een kader van stromale cellen die thymocyten migratie ondersteunt tijdens de ontwikkeling en efficiënte positieve en negatieve selectie ^11,32-39. Thymocyt subsets toegevoegd boven op de thymus plakjes migreren in het weefsel en hun geschikte micro-omgeving niche ^34,37. De overlay thymocyten kan worden onderscheiden van de thymus segment endogene cellen via congenic merkers of fluorescente labels en kunnen in kweek gedurende enkele dagen worden gehandhaafd. Thymus slice organotypische kweken kan worden gebruikt om verschillende aspecten bestuderenT cel ontwikkeling zoals thymus keuze, thymocyten gedrag (migratie en cellulaire interacties) en thymocyten lokalisatie, onder anderen. De mogelijkheid krijgen om ~ 20 thymus segmenten per muis genereren, de schaalbaarheid van experimenten in het algemeen groter dan andere in situ modellen van thymus selectie. Hoewel de bereiding van thymus segmenten vereist gespecialiseerde apparatuur, zoals de vibratome en de levensduur van thymus segmenten in cultuur beperkt blijven door celverlies tijd via celdood en het ontbreken van een inkapselend membraan, thymus segmenten vormen een uitstekend model voor de analyse van thymus selectie van gesynchroniseerde populaties van thymocyten binnen een volwassen thymus micromilieu. Hier beschrijven we de voorbereiding van de thymus plakjes (met inbegrip van het oogsten van de thymus, agarose inbedding van thymus lobben en vibratome snijden van het ingebedde weefsel), isolatie en overdeksel thymocyten en dissociatie van thymus plakken voor flowcytometrische analyse.