Neurodegeneración en un modelo animal de beta-amiloide crónica Oligómero de infusión es contrarrestado por el anticuerpo Tratamiento Con una infusión de bombas osmóticas

Ética declaración: El animal protocolo para este proyecto obtuvo la aprobación del Comité de Cuidado de Animales del Hôpital du Sacré-Coeur de Montreal de conformidad con las directrices del Consejo Canadiense de Protección de los Animales. 1. Catéter Preparación antes de la cirugía estereotáxica Cortar catéteres PE50 (6 cm de longitud) que se utilizan para conectar la cánula con bombas osmóticas (véase la Figura 1A). Llenar catéteres PE50 con líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) y sellar ambos extremos de los catéteres. Mantenga el catéter a 4 ° C hasta su uso. 2. La cánula de implantación por estereotaxia Realizar la cirugía en condiciones estériles. Esterilizar todos los instrumentos y materiales quirúrgicos en autoclave. Limpiar el aparato estereotáxico y la zona de trabajo a fondo, y desinfectado con una solución de etanol al 70%. Use una máscara quirúrgica, el capó del cabello y guantes estériles. Anestesiar ratas mediante la inyección por vía intraperitoneal (ip) una solución de ketamina y xilazina (100 mg / kg y 10 mg / kg, respectivamente). Confirmar la anestesia por el control de movimiento tras una pizca dedo del pie suave. Inyectar un no esteroide anti-inflamatorio (Meloxicam; 1 mg / kg) por vía subcutánea (sc) al animal anestesiado al menos 30 min antes de la cirugía. Afeitar la cabeza del animal usando las podadoras y desinfectar la piel con una solución de gluconato de clorhexidina al 2% y alcohol isopropílico al 2% tres veces. Aplique un ungüento oftálmico veterinario en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Colocar el animal en un marco estereotáxico con las barras de oído. Fijar una cánula en el brazo de soporte de la estructura estereotáxica. Inyectar (sc) un agente anestésico local (bupivacaína (1,5 mg / kg) y lidocaína (1,5 mg / kg) en la parte superior de la cabeza. La anestesia es mantiene durante todo el procedimiento mediante la colocación de un cono de nariz entrega de 3% de isoflurano. La totalidad campo quirúrgico debe estarcubrió apagado, pero no se llevó a cabo aquí para demostrar mejor la técnica. Hacer una incisión de 3 cm en la parte superior de la cabeza con un bisturí. Instalar 4 pinzas alrededor de la incisión para dejar claro el cráneo. Usando una tijera de punta redonda, hacer un bolsillo (2 x 2 cm 2) debajo de la piel entre los omóplatos del animal. Raspe el periostio del cráneo con una cuchilla. Aplique una compresa de gasa en el cráneo si el sangrado. Compruebe que el cráneo es plana y bien alineada en el marco estereotáxico. Para asegurarse de que el cráneo es plana, comprobar la altura de las coordenadas en el bregma y al lambda. Tomar las coordenadas de la bregma que será utilizada como punto de referencia. A partir de la bregma, calcular las coordenadas de los dos cánula guía que se implantan de forma bilateral en el hipocampo (anteroposterior: – 0,42 cm; mediolateral: ± 0,30 cm; dorsoventral: – 0,28 cm de acuerdo con el atlas de cerebro de rata de Paxinos y Watson) 29 . indicar elposición de la cánula con un marcador. Perforar un agujero (0,5 mm) en el cráneo en el momento de la implantación, tanto cánula. Taladro otros dos agujeros de aproximadamente 5 mm por encima y por debajo de los puntos para insertar tornillos que fortalecerán la cánula cuando se aplica el cemento dental. Corte un extremo del catéter previamente lleno de ACSF con un bisturí, y la inserta en el brazo angular de la cánula. Fijar la primera cánula con cemento dental. Evitar poner cemento dental alrededor de la posición en la segunda cánula. Dejar que el cemento dental seca durante 2 – 3 minutos, luego retire el brazo de soporte de la primera cánula, y fijar la segunda cánula en el mismo. Repita los pasos 2.11 y 2.12. Ponga cánula maniquí en tanto guía cánula. Asegúrese de que el maniquí y la guía de cánula son de la misma longitud para evitar la infiltración de tejido y el bloqueo de la cánula. Insertar el extremo libre de los dos catéteres en el bolsillo hecha previamente entre los omóplatos del animal. Retire las abrazaderas y coser la piel con unahilo de sutura 4-0. NOTA: La guía de cánula superior debe ser accesible para las próximas infusiones Aβo. Retire el animal del marco estereotáxico y poner de nuevo en su jaula. Durante la recuperación post-quirúrgica, colocar la jaula en una manta de calentamiento de agua hasta que el animal se despierta. La jaula debe ser parcialmente sobre la base de modo que la rata puede alejarse del calor si es necesario. Monitorear constantemente el animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener decúbito esternal. Volver ratas a las instalaciones de animales para recuperarse de la cirugía durante 10 días bajo estrecha vigilancia. NOTA: No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado. Meloxicam (1 mg / kg) se administra una vez al día durante dos días después de la cirugía para tratar el dolor. 3. Instalación de la bomba osmótica Un día antes de la instalación, llenar bombas osmóticas con anticuerpo 6E10 (1 mg / ml; 100 l) y IgG1 de controlanticuerpo (1 mg / ml; 100 l) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en condiciones estériles. Mantener las bombas en agua destilada estéril a 37 ° C durante la noche para activar las bombas. Anestesiar las ratas con isoflurano al 3% para instalar bombas osmóticas (0,5 l / h durante 7 días). Afeitado entre los omóplatos y desinfectar la piel con una solución de gluconato de clorhexidina al 2% y alcohol isopropílico al 2%. Hacer una incisión de 2 cm con un escalpelo entre los omóplatos para localizar los catéteres PE50 conectado a la cánula guía. Corte el extremo de los catéteres PE50 que contienen cemento dental con un bisturí. Conectar las bombas osmóticas para los catéteres PE50, y añadir un poco de cemento dental en la unión de la bomba y el catéter para asegurar la conexión. Coser la piel firmemente con un hilo de sutura 4-0. Ponga la parte posterior animal en su jaula en una almohadilla de calentamiento de agua. Observar la estela de los animales rápidamente a partir de una anestesia con isoflurano (unos 5 minutos). NOTA: La cirugía dura aproximadamente 5 a 10 min. 4. Aβo Infusiones en despierto y ratas con libertad de movimientos Preparar la solución Aβo (0,2 g / l) como se informó anteriormente. 28,30 Permitir Aβo a agregarse dinámicamente y de forma espontánea durante 1 hora a temperatura ambiente antes de la infusión. Instalar dos jeringas de 10 l en una bomba de infusión. Llenar las jeringas con 5 l de agua destilada estéril. Cortar dos catéteres PE50 a aproximadamente 60 cm de longitud con un bisturí. Llene los dos catéteres con agua destilada estéril utilizando 1 ml jeringas y agujas 21G. Mantener las jeringuillas de 1 ml en un extremo del catéter y conectar el otro extremo a las jeringas Hamilton. Retire las jeringas de 1 ml y comprobar que no hay burbujas de aire dentro de los catéteres. Insertar la cánula interna en el extremo de los catéteres PE50. El uso de agua destilada estéril, llenar la cánula interna conectada a catéteres PE50 hasta a 1 l de jeringas Hamilton. Hacer una burbuja de aire por pulling los pistones de hasta 2 l. Mezclar la solución Aβo la pipeta hacia arriba y hacia abajo utilizando una punta del mínimo de la adhesión. Evitar la formación de burbujas durante el mezclado. Llenar tanto cánula interna con 1,5 l de solución Aβo tirando hacia atrás los pistones hasta 3,5 l. Hacer líneas con un marcador antes y después de la burbuja de aire hecho en los dos catéteres. Esto sirve como un punto de infusión en curso de verificación. Para la infusión, poner la jaula cerca de la bomba de infusión y quitar la cubierta. Coloque la rata en recibir mimos y herméticamente raspar el brazo del Snuggle alrededor de su cuello para inmovilizar la cabeza de la rata. Retire la cánula ficticio de la cánula guía de dos. Insertar la cánula interna previamente preparado en la cánula guía. Compruebe que estén insertados completamente y bien fijados a la base de la cánula guía. Liberar la rata del Snuggle y poner de nuevo en su jaula para limitar el estrés contención. Vigilar de cerca para asegurarse de que los catéteres no se tuercen para ti conseguirella y la infusión se realiza correctamente. Encienda la bomba de infusión. Se inyecta 1 l de solución de Aβo a una velocidad de 0,1 l / min (10 min). Durante la infusión, compruebe que el pistón de la jeringa se mueve de 3,5 a 2,5 l l, y que la burbuja de aire en ambos catéteres PE50 se mueve continuamente. Deje la cánula interna en su lugar por otros 5 min después de la infusión para permitir la difusión eficiente de solución Aβo. Llevar la rata de vuelta en el snuggle para quitar la cánula interna y capsulado cánula guía para prevenir el reflujo de la solución inyectada. Utilice cánula ficticia que se detiene justo antes el brazo de ángulo de la cánula. Devolver el animal en su jaula. Repetir la perfusión Aβo una vez al día durante 6 días consecutivos. La eutanasia a los animales por decapitación.