מוחיים במודל חיה של עמילואיד-ביתא כרונית oligomer העירוי נוטרלה על ידי נוגדן טיפול חדורי משאבות אוסמוטי
Summary
To study the effects of Aβo in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble Aβo coupled with continuous infusion of Aβo antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of Aβo.
Abstract
ירידה בזיכרון מפורש תלוי בהיפוקמפוס (זיכרון עובדות ואירועים) היא אחד הסימפטום הקליני המוקדם של מחלת אלצהיימר (AD). היא מבוססת היטב כי הפסד הסינפסה ניוון מוחיים שהתפתח הם המנבאים הטובים ביותר עבור ליקויי זיכרון של מחלת אלצהיימר. המחקרים האחרונים הדגישו את תפקיד הנוירו של oligomers המסיס-בטא עמילואיד (Aβo) שמתחיל להצטבר במוח האנושי כ 10 עד 15 שנה לפני התסמינים הקליניים לעין. דיווחים רבים מצביעים על כך מסיסה Aβo לתאם עם גירעונות זיכרון במודלים ובני אדם לספירה. ניווניות של מערכת העצבים הנגרמת Aβo שנצפו תרבויות פרוסות עצביות ומוח כבר יותר מאתגר להתרבות במודלים של בעלי חיים רבים. המודל של חליטות Aβo חזרו המוצג כאן להתגבר על בעיה זו ולאפשר פונה שני תחומים מהותיים בפיתוח טיפולי שינוי מחלה חדש: לזהות סמנים ביולוגיים כדי לאבחן מחלת אלצהיימר מוקדם, ולקבוע את Mecha המולקולריתמנגנונים בבסיס Aβo הנגרמים גירעונות זיכרון בתחילה לספירה. מאז המצרפי Aβo מסיס יחסית מהר לתוך סיבי Aβ מסיסים המתואמים גרוע עם המדינה הקלינית של חולים, מסיס Aβo ערוך טרי והזריק פעם ביום במשך שישה ימים לייצר מוות של תאים ניכר בהיפוקמפוס. השתמשנו צינורית במיוחד לעצב לאינפוזיות סימולטני של Aβo ו עירוי מתמשך של נוגדן Aβo (6E10) בהיפוקמפוס באמצעות משאבות האוסמוטי. זה חדשני בשיטת vivo כעת ניתן להשתמש במחקרים פרה כדי לאמת את היעילות של טיפולים לספירה חדשים שעשויה למנוע בתצהיר ואת הרעילות העצבית של Aβo בחולים טרום דמנציה.
Introduction
זה בתחילה הוצע ההצטברות של מיני Aβ מסיסים במוח הייתה מרכזית בהיווצרות לספירה. 1,2 עם זאת, פלאקים של עמילואיד גם מזוהים בחלק קוגניטיבית נורמלי קשישים. 3-7 כדי להתגבר על קורלציה החלשה קיימת בין תצהירי רובד ליקויים קוגניטיביים ב AD, הדיווחים האחרונים הראו הנוכחות של Aβo המסיס הרעיל בתחילת המחלה, בעלי המתאם הרבה יותר טוב עם המדינה הקלינית של המטופלים. 8-14 מאחר שתהליך oligomerization Aβ הוא דינמי מאוד, הוצע כי neurotoxicity הוא המושרה על ידי שונים Aβo במקום סוג של oligomer ספציפי אחד בלבד. 14-16 מאחר ומחקרים רבים הראו כי Aβo יכול ליזום תפקוד סינפסה לפני הסינפסה איבוד עצבי, מצביעים 17-24 תיאוריות עכשוויות שטיפול הקשורות Aβ עשוי להיות יעיל AD מוקדם ולא בשלבים מאוחרים יותר כפי שנבדקו עד כה בניסויים קליניים.
תכונת סימן היכר אחד בפתוגנזה AD היא המוות של התאים מסיביים ונפוץ שנצפה בשלבים המאוחרים של המחלה, ואת סינפסה המשמעותית איבוד עצבי שנצפה אזורים במוח מקומיים כאשר גירעונות זיכרון להפוך לגילוי ברמה הקלינית. מסלול perforant מקרין מן קליפת entorhinal (EC) כדי gyrus המשוננת (DG) הוא מוטרד באופן ניכר על ההתפרצות המוקדמת של מחלת אלצהיימר. 25,26 במהלך מדינת prodromal של ספירה, כאשר ליקוי קוגנטיבי מתון (MCI) הופך מוות של תאים משמעותיים לכאורה כמו גם אובדן הסינפטי מזוהה ב EC של DG. 25,26
למרות גוף גדול של ראיות אתר את הפעולה הרעילה של Aβo המסיס לספירה מוקדם, 8-14 Aβo הנגרם ניוון מוחיה שנצפה תרבות העצבית או תרבות פרוסת מוח organotypic כבר יותר מאתגר להתרבות במודלים של בעלי חיים. 27 רוב לספירה המהונדסת מודלים overexpressingיש β פלאקים של עמילואיד, hyperphosphorylation טאו, חסר הסינפטי גירעונות זיכרון. 27 עם זאת, המודלים האלה כבר הרבה פחות מוצלחים מוות של תאי דוגמנות נצפה בהיפוקמפוס של חולי אלצהיימר. כדי להתגבר על הבעיות הטכניות פיתחנו מודל המבוסס על חליטות תוך-מוחי של מסיס Aβo. דיווחנו קודם לכן כי חזרתי חליטות בהיפוקמפוס של מסיס Aβo לגרום איבוד עצבי הדרגתי hyperphosphorylation טאו, שני סימנים מובהקים פתולוגי קשור עם ירידה בזיכרון של מחלת אלצהיימר. 28 הנה, אנחנו מראים שיטה חדשה לבדוק טיפולי AD באמצעות צינורית במיוחד לעצב לאינפוזיות סימולטני של Aβo ו עירוי מתמשך של נוגדן Aβo (6E10) עם משאבות האוסמוטי.
משאבות אוסמוטי מספקים דרך ייחודית לבחון in vivo את היעילות של כל הנוגדנים (או תרכובות אחרות) נגד ניוון מוחיים הנגרמת Aβo ישירות באתר עירוי של Aβo. לכן, אלה משאבות represent כלי נוח להקים הוכחה של קונספט מוצק לגבי מנגנוני הפעולה של תרופות פוטנציאליות של מחלת אלצהיימר. מאז הדיווחים אחרונים מצביעים על ההשפעה הקריטית של מסיס Aβo בשלבים המוקדמים של מחלת אלצהיימר, טיפולים רבים מכוונים Aβo הם למעשה נבדקו על ידי מעבדות אוניברסיטאיות והפרמצבטיקה. במודל חית הרומן הזה מאפשר מחק את ההפסד הסינפטי עצבי שנצפה לספירה מוקדם, ומשאבות האוסמוטי משמשות להחדיר סוכני טיפול רציף באופן ספציפי את האינפוזיה Aβo. הכישלונות החוזרים של טיפולים לספירה נבחנה לאורך השנים האחרונות קל עד בינוני חולים כפי שתתבקש החוקרים להתחיל מחקרים בחולים טרום דמנציה לפני Aβo מתחילים לצבור בשפע וליצור נזק מוחי בלתי הפיך. בהקשר זה, בדיקת תרכובות חדשות המונעות בתצהיר וכתוצאה מכך ברעילות של Aβo שאולי יעניינו בחולים טרום קליניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול זה שדרש תשומת לב מיוחדת. כאשר השתלת הצינורית אל תשים דבק דנטלי כאשר הוא נוזלי מדי כדי למנוע חסימת החור של הצינורית השנייה. חשוב למקם דבק דנטלי בסוף ללא קטטר P50 המצורף המשאבה כדי למנוע גירוי תגובה דלקתית אפשרית. ביום של הניתוח stereotaxic, להשתמש צינורית דמה כי הם באותו אורך כמו צינורית מדריך כדי למנוע חסימת צינורית. עם זאת, לאחר התקנת משאבות להשתמש צינורית דמה קצרה לזה לעצור לפני זרוע הזווית של הצינורית כדי לאפשר חליטה נכונה של הפתרון מהמשאבה ההיפוקמפוס. לעקוב מקרוב חליטות Aβo ולוודא כי בועת האוויר נעשתה צנתרים נעה באופן רציף במהלך חליטות. תמיד לוודא כי צינורית ההזרקה מוכנסת כהלכה לתוך צינורית המדריך במהלך חליטות.
אם הבעיה היא המפגש במהלך עירוי Aβ, ודא כי הצינורית הפנימית אינה חסומה. אם זה מקרה, שטוף מים מזוקקים סטריליים באמצעות הצינורית הפנימית. אם צינורית המדריך חסומה, להפוך את הצינורית הפנימית לתוך צינורית המדריך. אחרת להעביר את הצינורית הפנימית למעלה ולמטה. מריבה של לְהִצְטָנֵף יכולה להיות מלחיצה עבור חולדות, במיוחד ביום הראשון. כדי להקטין את הלחץ של בעל החיים, אנו ממליצים לתמרן להרגיל חולדות אל לְהִצְטָנֵף לפני הניתוח stereotaxic.
יתרונות רבים ניתן לייחס הרומן הזה וגמישים בגישה vivo. אכן, אופי Aβo מוזרק ניתן לשלוט במדויק לפני עירוי, וסוג שונים של ההכנות Aβ (עבור סינתטי למשל לעומת פתרונות Aβ שמופק מהמוח) ניתן להזריק להעריך neurotoxicity שלהם in vivo. מודל זה יכול לשמש גם כדי לחקור מנגנונים שבאמצעותם מיני Aβ שונים (למשל, מונומרים מעוטים ו-משקל גבוה מולקולרי oligomers, protofibrils) יכול לגרום שפעות הנוירו in vivo, וכיצד טיפולים כמו אימונותרפיה עשויים לנטרל ההשפעה המזיקה שלהם במוח. מאז החליטות הן להופיע ערות, חיות בחופשיות-נעימות, אין תופעות של בלבול בין סוכני הרדמה ופתרון Aβo על מסלולי איתות, כפי שמוצגים במחקרים קודמים. 32,33 עירויים ב לנוע בחופשיות בעלי חיים גם עולות בקנה אחד עם בדיקות התנהגותיות כל זמן לפני ואחרי החליטות.
עירויים של Aβo והתקנת משאבה יכול להיעשות חיה בגילאים שונים כדי לקבוע את ההשפעות של Aβo וטיפולים במהלך ההזדקנות. מאז ניווניות של מערכת העצבים מתרחשת בסביבת האתר עירוי, הסינפסה איבוד עצבי יכול להיגרם באזורי מוח שונים מקומי. החליטה בטחונות של Aβo והבקרה (רכב או לטרוף Aβ) מאפשרות שליטה על כל שינוי בתוך החיה אותו. לעומת זאת, Aβo או שליטה solutions ניתן להזריק בשני צידי ימין ועל שמאל ההיפוקמפוס, למשל כאשר בודקים חי משימות התנהגותיות. עירוי של Aβo וטיפול ניתן לעשות בו זמנית או לחילופין משאבות ניתן להתקין לאחר עירוי Aβo להעריך אם הטיפול הוא יעיל לאחר בתצהיר Aβ. אותו הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש גם כשעושים חליטות intracerebroventricular של Aβo. השפעת Aβo על מסלולי איתות תאיים ניתן להעריך לפני ואחרי איבוד עצבי בתוך פרק זמן קצר למדי. המינון ומספר חליטות Aβ יכול גם להיות מותאם כדי להשיג פחות או יותר חמור פתוגניות Aβ.
אמנם מאוד תכליתי, טכניקה זו יש מספר מגבלות. קניית השתלה מייצרת הפרעה מכאנית של הרקמות neuroinflammation בימים הראשונים לאחר ניתוח. לכן, זה הכרחי לחכות לפחות שבוע לאחר הניתוח לפני תחילת Aβo infuשיאון, וכדי להוסיף בקרות נאותות (הזרקה של רכב או לטרוף פעיל Aβ) לקחת בחשבון את האירועים הללו. כמו כן, רק נפח קטן של Aβo יכול להיות חדור להגביל דיפוזיה של הפתרון.
המשאבות האוסמוטי מייצגות שיטת הצגה נוחה וייחודית עבור אימות פרה-קלינית של סוכנים שנועדו למנוע ניוון מוחיה הנגרמת Aβ. מאז אימונותרפיה עם נוגדן 6E10 הוכחה בעבר כדי להקטין הצטברות Aβ במוח, 31 השתמשנו נוגדני 6E10 כהוכחה-of-concept כדי לאמת גישת in vivo החדשה שלנו. The Used של משאבות האוסמוטי במודל זה אולי כעת ניתן להשתמש כדי לפתח טיפולים שינוי המחלה הרומן הזה יכול למנוע בתצהיר ואת הרעילות העצבית של Aβo בחולי אלצהיימר פרה-קליניים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Caroline Bouchard from the animal facility for the rat work. A.S. holds a J.A. De Sève master fellowship, and B.P. a COPSE fellowship from the Université de Montréal This work was funded by grants attributed to J.B. from FRQS-Pfizer and start-up funds from Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal Research Center.
Materials
| Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) | Harvard Apparatus | 59-7316 | |
| PE50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
| Ketamine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bioniche | 1989529 | |
| Xylaxine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bimeda | 8XYL004C | |
| Meloxicam (5 mg/mL) | Norbrook | 215670I01 | |
| Solution of chlorhexidine gluconate 2% and isopropyl alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
| Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
| Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
| ophthalmic ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
| stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
| stereotaxic cannula holder arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
| Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
| Guide Cannula | Plastics one | 326OPG/spc | |
| Injection Cannula | Plastics one | C315I/spc | |
| Dummy Cannula | Plastics one | C315DC/spc | |
| Suture thread coated vicryl rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
| Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
| Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
| 6E10 antibody (mouse IgG1 isotype) | BioLegend | 803003 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | AB18447 | |
| Alzet osmotic pumps model 1007D | Durect corporation | 290 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Amyloid-beta 1-42 | rPeptide | A-1163-1 | |
| Hamilton syringe (10 µL) | Fisher Scientique | 14815279 | |
| Infusion Syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
| Needle 21G | Terumo | NN-2125R | |
| Snuggle | Lomir Biomedical | RTS04 |
References
- Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer’s disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256, 184-185 (1992).
- Selkoe, D. J. Toward a comprehensive theory for Alzheimer’s disease. Hypothesis: Alzheimer’s disease is caused by the cerebral accumulation and cytotoxicity of amyloid beta-protein. Ann. N.Y. Acad. Sci. 924, 17-25 (2000).
- Terry, R. D., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer’s disease: synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30, 572-580 (1991).
- Giannakopoulos, P., et al. Tangle and neuron numbers, but not amyloid load, predict cognitive status in Alzheimer’s disease. Neurology. 60, 1495-1500 (2003).
- Price, J. L., Morris, J. C. Tangles and plaques in nondemented aging and “preclinical” Alzheimer’s disease. Ann. Neurol. 45, 358-368 (1999).
- Reiman, E. M., et al. Fibrillar amyloid-beta burden in cognitively normal people at 3 levels of genetic risk for Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6820-6825 (2009).
- Aizenstein, H. J., et al. Frequent amyloid deposition without significant cognitive impairment among the elderly. Arch. Neurol. 65, 1509-1517 (2008).
- Mc Donald, J. M., et al. The presence of sodium dodecyl sulphate-stable Abeta dimers is strongly associated with Alzheimer-type dementia. Brain. 133, 1328-1341 (2010).
- Tomic, J. L., Pensalfini, A., Head, E., Glabe, C. G. Soluble fibrillar oligomer levels are elevated in Alzheimer’s disease brain and correlate with cognitive dysfunction. Neurobiol. Dis. 35, 352-358 (2009).
- Naslund, J., et al. Correlation between elevated levels of amyloid beta-peptide in the brain and cognitive decline. JAMA. 283, 1571-1577 (2000).
- Hardy, J. Amyloid double trouble. Nat. Genet. 38, 11-12 (2006).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 101-112 (2007).
- McLean, C. A., et al. Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer’s disease. Ann. Neurol. 46, 860-866 (1999).
- Hepler, R. W., et al. Solution state characterization of amyloid beta-derived diffusible ligands. Biochemistry. 45, 15157-15167 (2006).
- Martins, I. C., et al. Lipids revert inert Abeta amyloid fibrils to neurotoxic protofibrils that affect learning in mice. EMBO J. 27, 224-233 (2008).
- Lesne, S., et al. A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory. Nature. 440, 352-357 (2006).
- Hung, L. W., et al. Amyloid-beta peptide (Abeta) neurotoxicity is modulated by the rate of peptide aggregation: Abeta dimers and trimers correlate with neurotoxicity. J. Neurosci. 28, 11950-11958 (2008).
- Ono, K., Condron, M. M., Teplow, D. B. Structure-neurotoxicity relationships of amyloid beta-protein oligomers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 14745-14750 (2009).
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 6448-6453 (1998).
- Shankar, G. M., et al. Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer’s brains impair synaptic plasticity and memory. Nat. Med. 14, 837-842 (2008).
- Shankar, G. M., et al. Natural oligomers of the Alzheimer amyloid-beta protein induce reversible synapse loss by modulating an NMDA-type glutamate receptor-dependent signaling pathway. J. Neurosci. 27, 2866-2875 (2007).
- Cleary, J. P., et al. Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function. Nat. Neurosci. 8, 79-84 (2005).
- Townsend, M., Shankar, G. M., Mehta, T., Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Effects of secreted oligomers of amyloid beta-protein on hippocampal synaptic plasticity: a potent role for trimers. J. Physiol. 572, 477-492 (2006).
- Gomez-Isla, T., et al. Profound loss of layer II entorhinal cortex neurons occurs in very mild Alzheimer’s disease. J. Neurosci. 16, 4491-4500 (1996).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5, 417-421 (1996).
- Brouillette, J. The Effects of Soluble Abeta Oligomers on Neurodegeneration in Alzheimer’s Disease. Curr. Pharm. Des. 20, 2506-2519 (2014).
- Brouillette, J., et al. Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-beta1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model. J. Neurosci. 32, 7852-7861 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- Broersen, K., et al. A standardized and biocompatible preparation of aggregate-free amyloid beta peptide for biophysical and biological studies of Alzheimer’s disease. PEDS. 24, 743-750 (2011).
- Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 4501-4506 (2009).
- Papon, M. A., Whittington, R. A., El-Khoury, N. B., Planel, E. Alzheimer’s disease and anesthesia. Front. Neurosci. 4, 272 (2011).
- Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
