Neurodegenerazione in un modello animale di cronica amiloide-beta Oligomer infusione viene neutralizzata da anticorpi trattamento infuso con pompe osmotiche
Summary
To study the effects of Aβo in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble Aβo coupled with continuous infusion of Aβo antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of Aβo.
Abstract
Diminuzione della memoria esplicita ippocampo-dipendente (memoria per fatti ed eventi) è uno dei primi sintomi clinici della malattia di Alzheimer (AD). E 'ben noto che la perdita di sinapsi e la neurodegenerazione conseguente sono i migliori predittori per deficit di memoria in AD. Recenti studi hanno evidenziato il ruolo neurotossico degli oligomeri beta-amiloide solubili (Aβo) che cominciano ad accumularsi nel cervello umano da circa 10 a 15 anni prima che i sintomi clinici si manifestano. Molti rapporti indicano che solubile Aβo correlano con deficit di memoria nei modelli AD e gli esseri umani. La neurodegenerazione Aβo indotta osservato nelle culture fetta neuronali e cerebrali è stato più difficile da riprodurre in molti modelli animali. Il modello di infusioni ripetute Aβo mostrato qui a superare questo problema e consentire affrontando due settori chiave per lo sviluppo di nuove terapie modificanti la malattia: identificare marcatori biologici per la diagnosi precoce dC, e determinare il mecha molecolarenismi alla base di deficit della memoria Aβo-indotte al momento della comparsa di AD. Dal solubile aggregato Aβo relativamente veloce in fibrille Ap insolubili che correlano poco con lo stato clinico dei pazienti, solubile Aβo sono preparati freschi e iniettato una volta al giorno per sei giorni di tempo per produrre la morte cellulare marcata nell'ippocampo. Abbiamo usato cannula specialmente disegno per infusioni simultanee di Aβo e infusione continua di anticorpi Aβo (6E10) nell'ippocampo con pompe osmotiche. Questo innovativo metodo vivo può ora essere utilizzato in studi pre-clinici per validare l'efficacia di nuove terapie AD che potrebbero impedire la deposizione e la neurotossicità di Aβo in pazienti pre-demenza.
Introduction
E 'stato inizialmente proposto che l'accumulo di specie A? Insolubili nel cervello era centrale per patogenesi. 1,2 Tuttavia, placche amiloidi vengono rilevate anche in alcuni cognitivamente normali anziani. 3-7 Per superare la scarsa correlazione esistente tra le deposizioni di placca e deficit cognitivi in aD, ultime relazioni hanno evidenziato la presenza di Aβo solubili tossici nel insorgenza della malattia, che correlano meglio con lo stato clinico dei pazienti. 8-14 Poiché il processo di oligomerizzazione Ap è molto dinamico, è stato suggerito che neurotossicità è indotta da vari Aβo anziché soltanto uno specifico tipo di oligomero. 14-16 Poiché molti studi hanno dimostrato che Aβo può avviare disfunzioni sinaptiche prima di sinapsi e perdita neuronale, 17-24 teorie attuali indicano che il trattamento Ap correlati potrebbe essere efficace in aD presto piuttosto che nelle fasi successive come testato finora negli studi clinici.
Una caratteristica segno distintivo di patogenesi è la morte massiccia e diffusa di cellule osservate nelle ultime fasi della malattia, e la sinapsi significativa e perdita neuronale osservata in regioni cerebrali localizzate quando i deficit di memoria diventano rilevabili a livello clinico. Il percorso perforant che sporge dalla corteccia entorinale (CE) al giro dentato (DG) è perturbato notevolmente alla precoce insorgenza di AD. 25,26 Durante lo stato prodromica di AD, quando decadimento cognitivo lieve (MCI) diventa evidente la morte delle cellule significativo viene rilevato nella CE così come la perdita sinaptica nella DG. 25,26
Anche se una grande quantità di prove ha individuato l'azione tossica dei solubili Aβo in AD all'inizio, 8-14 neurodegenerazione Aβo indotta osservato nella cultura neuronale o organotipica cultura fetta cervello è stato più difficile da riprodurre in modelli animali. 27 La maggior parte del transgenico AD modelli overexpressing Aβ hanno placche amiloidi, tau iperfosforilazione, carenza sinaptica e deficit di memoria. 27 Tuttavia, questi modelli sono stati molto meno successo nella morte cellulare osservata modellazione nell'ippocampo dei pazienti con AD. Per superare questi problemi tecnici abbiamo sviluppato un modello basato su infusioni intracerebrali di solubile Aβo. Abbiamo riportato in precedenza che ripetono infusioni dell'ippocampo di solubile Aβo inducono graduale perdita neuronale e tau iperfosforilazione, due caratteristiche patologiche associate con il declino della memoria in AD. 28 Qui, stiamo mostrando un nuovo metodo per testare terapie AD utilizzando cannula specialmente disegno per infusioni simultanee di Aβo e infusione continua di anticorpi Aβo (6E10) con pompe osmotiche.
Pompe osmotiche forniscono un modo unico per testare in vivo l'efficacia di qualsiasi anticorpo (o altri composti) contro la neurodegenerazione Aβo indotta direttamente al sito di infusione di Aβo. Così, queste pompe reprESENT un comodo strumento per stabilire un solido proof-of-concept per quanto riguarda i meccanismi di azione di potenziali agenti terapeutici in AD. Dal momento che i rapporti recenti indicano l'impatto critico di solubili Aβo nelle prime fasi dell'Alzheimer, molti trattamenti diretti verso Aβo sono effettivamente testati da laboratori accademici e farmaceutici. Questo modello animale romanzo permette imitando la perdita sinaptica e neuronale osservata in AD presto, e pompe osmotiche sono utilizzati per infondere continuamente agenti di trattamento specificamente al sito di infusione Aβo. I fallimenti ripetuti delle terapie AD testati nel corso degli ultimi anni in lieve a moderata pazienti spinto i ricercatori ad avviare studi clinici in pazienti pre-demenza prima Aβo cominciano ad accumularsi in abbondanza e generare danni irreversibili al cervello. In questo contesto, sperimentazione di nuovi composti che impediscono la deposizione e di conseguenza la neurotossicità di Aβo potrebbe essere di interesse in pazienti pre-clinici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono passaggi critici all'interno di questo protocollo che ha richiesto una particolare attenzione. Quando impiantare la cannula, evitare di mettere cemento dentale quando è troppo liquido per impedire il blocco nel foro della seconda cannula. È importante mettere cemento dentale in corrispondenza dell'estremità libera del catetere P50 collegata alla pompa per evitare irritazioni e una possibile risposta infiammatoria. Il giorno della chirurgia stereotassica, utilizzare cannula fittizio che sono della stessa lunghezza guida cannula per evitare il bloccaggio della cannula. Tuttavia, dopo l'installazione di pompe utilizzano più breve cannula fittizio che ferma prima che il braccio angolare della cannula per consentire una corretta infusione della soluzione dalla pompa per l'ippocampo. Monitorare attentamente infusi Aβo e verificare che la bolla d'aria fatto in cateteri si muove continuamente durante l'infusione. Verificare sempre che la cannula iniezione sia completamente inserito nella cannula guida durante le infusioni.
Se il problema è l'incontro durante l'infusione A?, Verificare che la cannula interna non sia bloccato. Se è il caso, lavare acqua distillata sterile attraverso la cannula interna. Se la cannula guida è ostruito, girare la cannula interna nella cannula guida. Altrimenti spostare la cannula interna su e giù. Contesa nel coccole può essere stressante per i ratti, soprattutto il primo giorno. Per diminuire lo stress dell'animale, si consiglia di manipolare e abituarsi ratti al coccole prima della chirurgia stereotassica.
Molti vantaggi possono essere attribuiti a questo romanzo e flessibile approccio vivo. Infatti, la natura di Aβo iniettato può controllare accuratamente prima dell'infusione, e vari tipi di preparazioni Ap (ad esempio sintetico vs soluzioni Ap cervello-derivato) può essere iniettato per valutare il loro neurotossicità in vivo. Questo modello può essere utilizzato anche per studiare i meccanismi con cui varie specie di Ap (ad esempio, monomeri, a basso e ad alto peso molecolare oloigomers, protofibrille) possono indurre effetti neurotossici in vivo, e come trattamenti come l'immunoterapia potrebbero neutralizzare il loro impatto deleterio nel cervello. Dal momento che le infusioni sono esibiscono in sveglio, animali liberamente in movimento, non ci sono effetti confondenti tra agenti anestetici e la soluzione Aβo su vie di segnalazione, come dimostrato in studi precedenti. 32,33 Infusi di muoversi liberamente animali sono compatibili anche con test comportamentali qualsiasi tempo prima e dopo le infusioni.
Infusi di Aβo e l'installazione della pompa può essere fatto in animali di età diverse per determinare gli effetti di Aβo e trattamenti durante l'invecchiamento. Dal momento che la neurodegenerazione si verifica in prossimità del sito di infusione, sinapsi e la perdita neuronale possono essere indotte in diverse e localizzate regioni del cervello. L'infusione di garanzia Aβo e controllo (veicolo o scramble Ap) consente il controllo per ogni cambiamento all'interno dello stesso animale. Al contrario, Aβo o il controllo solutions possono essere iniettati bilateralmente destra e sinistra ippocampo, per esempio quando si verifica animali compiti comportamentali. L'infusione di Aβo e il trattamento può essere effettuato anche, o pompe possono essere installate dopo Aβo infusione per valutare se il trattamento è efficace dopo la deposizione Ap. Lo stesso protocollo qui descritto può essere utilizzato anche quando si fa infusi intracerebroventricular di Aβo. L'effetto di Aβo su vie di segnalazione intracellulare può essere valutato prima e dopo la perdita neuronale in tempi ragionevolmente brevi di tempo. La dose e numero di infusioni Ap possono essere regolati per ottenere un più o meno grave Ap patogenicità.
Sebbene molto versatile, questa tecnica presenta alcune limitazioni. Cannula l'impianto produce una rottura meccanica del tessuto e neuroinfiammazione nei primi giorni dopo l'intervento. Pertanto, è essenziale attendere almeno una settimana dopo l'intervento chirurgico prima di iniziare Aβo INFUSion, e di aggiungere controlli adeguati (iniezione di veicolo o scramble inattiva Ap) da prendere in considerazione questi eventi. Inoltre, soltanto un piccolo volume di Aβo può essere infuso per limitare la diffusione della soluzione.
Le pompe osmotiche rappresentano un metodo di consegna conveniente e unica per la validazione preclinica di agenti destinati a prevenire la neurodegenerazione Ap-indotta. Poiché immunoterapia con l'anticorpo 6E10 è stato precedentemente dimostrato di ridurre l'accumulo di Ap nel cervello, 31 abbiamo utilizzato l'anticorpo 6E10 come concetto prova di convalidare la nostra nuova vivo approccio. La utilizzato delle pompe osmotiche in questo modello potrebbe essere utilizzato per sviluppare nuove terapie modificanti la malattia che potrebbero impedire la deposizione e la neurotossicità di Aβo nei pazienti AD pre-clinici.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Caroline Bouchard from the animal facility for the rat work. A.S. holds a J.A. De Sève master fellowship, and B.P. a COPSE fellowship from the Université de Montréal This work was funded by grants attributed to J.B. from FRQS-Pfizer and start-up funds from Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal Research Center.
Materials
| Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) | Harvard Apparatus | 59-7316 | |
| PE50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
| Ketamine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bioniche | 1989529 | |
| Xylaxine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bimeda | 8XYL004C | |
| Meloxicam (5 mg/mL) | Norbrook | 215670I01 | |
| Solution of chlorhexidine gluconate 2% and isopropyl alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
| Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
| Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
| ophthalmic ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
| stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
| stereotaxic cannula holder arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
| Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
| Guide Cannula | Plastics one | 326OPG/spc | |
| Injection Cannula | Plastics one | C315I/spc | |
| Dummy Cannula | Plastics one | C315DC/spc | |
| Suture thread coated vicryl rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
| Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
| Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
| 6E10 antibody (mouse IgG1 isotype) | BioLegend | 803003 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | AB18447 | |
| Alzet osmotic pumps model 1007D | Durect corporation | 290 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Amyloid-beta 1-42 | rPeptide | A-1163-1 | |
| Hamilton syringe (10 µL) | Fisher Scientique | 14815279 | |
| Infusion Syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
| Needle 21G | Terumo | NN-2125R | |
| Snuggle | Lomir Biomedical | RTS04 |
References
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