التنكس العصبي في نموذج حيواني من المزمن اميلويد بيتا قليل وحدات ضخ وتصدى بواسطة الأجسام المضادة العلاج يملؤه المضخات الأسموزية
Summary
To study the effects of Aβo in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble Aβo coupled with continuous infusion of Aβo antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of Aβo.
Abstract
تراجع في الذاكرة واضحة تعتمد على الحصين (ذاكرة للوقائع والأحداث) هو واحد من أقرب أعراض سريرية لمرض الزهايمر (AD). ومن الثابت أن فقدان المشبك وما تلاها من التنكس العصبي هي أفضل تنبئ عن ضعف الذاكرة في ميلادي. وقد أكدت أحدث الدراسات دور أعصاب من الأوليغومرات اميلويد بيتا القابلة للذوبان (Aβo) التي تبدأ تتراكم في الدماغ البشري ما يقرب من 10 إلى 15 سنة قبل أن تصبح الأعراض السريرية واضحة. وتشير العديد من التقارير أن ذوبان Aβo ترتبط مع العجز في الذاكرة في نماذج م والبشر. كان التنكس العصبي الناجم عن Aβo الملحوظ في الثقافات شريحة العصبية والدماغ أكثر تحديا لإعادة إنتاج في العديد من النماذج الحيوانية. نموذج ضخ Aβo المتكررة هو موضح هنا التغلب على هذه المسألة، والسماح معالجة اثنين من المجالات الرئيسية لتطوير علاجات جديدة المرض تعديل: تحديد العلامات البيولوجية لتشخيص مبكر م، وتحديد ميكا الجزيئيnisms التي تقوم عليها العجز في الذاكرة الناجم عن Aβo-في بداية م. منذ مجموع Aβo ذوبان سريع نسبيا في الألياف غير القابلة للذوبان Aβ التي ترتبط بشكل سيئ مع الدولة السريرية للمرضى، تعد قابلة للذوبان Aβo الطازجة وحقن مرة واحدة يوميا لمدة ستة أيام لإنتاج موت الخلايا ملحوظ في قرن آمون. كنا قنية تصميم خصيصا للدفعات في وقت واحد من Aβo واستمرار تدفق Aβo الضد (6E10) في قرن آمون باستخدام مضخات التناضحي. هذا مبتكرة في طريقة الجسم الحي يمكن أن تستخدم الآن في الدراسات قبل السريرية للتحقق من كفاءة العلاجات م جديدة قد منع ترسب والعصبية من Aβo مرضى قبل الخرف.
Introduction
واقترح في البداية كان أن تراكم الأنواع Aβ غير قابلة للذوبان في الدماغ المركزي لم المرضية. 1،2 ومع ذلك، تم الكشف عن اللويحات النشوانية أيضا في بعض وضعها الطبيعي معرفيا كبار السن. 3-7 للتغلب على ضعف العلاقة القائمة بين ترسبات البلاك والعجز المعرفي في ميلادي، وقد أظهرت أحدث التقارير وجود Aβo قابل للذوبان سامة في بداية المرض، الذي ربط أفضل بكثير مع الدولة السريرية للمرضى. 8-14 منذ عملية Aβ oligomerization وديناميكية للغاية، واقترح أن العصبية يسببها مختلف Aβo بدلا من نوع واحد محدد فقط من قليل وحدات 14-16 منذ أظهرت العديد من الدراسات أن Aβo يمكن بدء الاختلالات المشبك قبل المشبك وفقدان الخلايا العصبية، 17-24 النظريات الحالية تشير إلى أن المعاملة المتعلقة Aβ-قد تكون فعالة في م في وقت مبكر بدلا من في مراحل لاحقة كما تم اختبارها حتى الآن في التجارب السريرية.
واحدة سمة مميزة لم المرضية هي القتل الجماعي وعلى نطاق واسع الخلية لوحظ في مراحل متأخرة من المرض، والمشبك كبير وفقدان الخلايا العصبية التي لوحظت في مناطق الدماغ المترجمة عندما تصبح العجز في الذاكرة للكشف على المستوى السريري. وأقلقت مسار الثاقب أن المشاريع من القشرة المخية الأنفية الداخلية (EC) إلى التلفيف المسنن (DG) بشكل ملحوظ في وقت مبكر من بداية م. 25،26 خلال الدولة البادري ميلادي عندما الضعف الادراكي المعتدل (MCI) يصبح واضحا موت الخلايا كبيرا تم الكشف في المفوضية الأوروبية، فضلا عن فقدان متشابك في المديرية العامة. 25،26
على الرغم من أن مجموعة كبيرة من الأدلة قد حددوا للعمل السامة من Aβo قابل للذوبان في أوائل م، 8-14 التنكس العصبي الناجم عن Aβo-لوحظ في ثقافة العصبية أو عضوي النمط ثقافة شريحة الدماغ كان أكثر تحديا لإعادة إنتاج في النماذج الحيوانية. 27 معظم المعدلة وراثيا م نماذج overexpressing وβ يكون لويحات الأميلويد، hyperphosphorylation تاو، ونقص متشابك والعجز في الذاكرة. 27 ومع ذلك، فإن هذه النماذج أقل نجاحا كبيرا في موت الخلايا النمذجة التي لوحظت في الحصين من المرضى ميلادي. للتغلب على هذه المسائل التقنية وضعنا نموذج يقوم على ضخ داخل المخ من Aβo قابل للذوبان. نحن ذكرت في وقت سابق أن تكرار الحقن الحصين من Aβo قابل للذوبان تحفز فقدان الخلايا العصبية تدريجية وhyperphosphorylation تاو، وهما بصمات المرضية المرتبطة تراجع الذاكرة في ميلادي 28 هنا، فإننا نبين طريقة رواية لاختبار علاجات م باستخدام قنية تصميم خصيصا للدفعات في وقت واحد من Aβo واستمرار تدفق Aβo الضد (6E10) مع مضخات التناضحي.
توفر مضخات التناضحي طريقة فريدة لاختبار في الجسم الحي كفاءة أي الأجسام المضادة (أو غيرها من المركبات) ضد التنكس العصبي الناجم عن Aβo مباشرة في الموقع ضخ Aβo. وهكذا، وهذه المضخات reprESENT أداة ملائمة لإنشاء إثبات صحة مفهوم صلبة فيما يتعلق بآليات عمل وكلاء العلاجية المحتملة في م. منذ التقارير الأخيرة تشير إلى الأهمية الحاسمة التي Aβo قابل للذوبان في المراحل المبكرة من الميلاد، هي في الواقع يجري اختبار العديد من العلاجات الموجهة نحو Aβo من قبل مختبرات الأكاديمية والمستحضرات الصيدلانية. هذا نموذج حيواني رواية يسمح محاكاة فقدان متشابك والعصبية التي لوحظت في وقت مبكر م، وتستخدم مضخات التناضحي للبث بشكل مستمر وكلاء العلاج تحديدا في موقع الحقن Aβo. إخفاقات المتكررة من العلاجات م اختبارها على مدى السنوات القليلة الماضية في خفيفة الى معتدلة المرضى كما دفعت الباحثين إلى بدء المحاكمات في المرضى قبل الخرف قبل Aβo تبدأ تتراكم بكثرة وتوليد تلف في الدماغ لا رجعة فيه. في هذا السياق، واختبار المركبات الجديدة التي تمنع ترسب وبالتالي العصبية من Aβo قد تكون ذات فائدة للمرضى ما قبل السريرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك خطوات حاسمة في هذا البروتوكول التي تتطلب اهتماما خاصا. عندما غرس قنية، وتجنب وضع الاسمنت الأسنان عندما يكون السائل أيضا لمنع عرقلة ثقب في قنية الثانية. من المهم أن تضع الاسمنت الأسنان في نهاية خالية من القسطرة P50 تعلق على مضخة لمنع تهيج والاستجابة الالتهابية الممكنة. في يوم من الجراحة التجسيمي، واستخدام قنية همية التي هي نفس طول دليل قنية لتجنب عرقلة قنية. ومع ذلك، بعد تثبيت تستخدم مضخات أقصر قنية همية أن تتوقف قبل الذراع زاوية قنية للسماح ضخ السليم من الحل من المضخة إلى الحصين. تراقب عن كثب ضخ Aβo والتحقق من أن فقاعة الهواء عمله في القسطرة يتحرك بشكل مستمر خلال ضخ. تأكد من أن قنية الحقن يتم إدخال تماما في قنية دليل خلال ضخ دائما.
إذا كانت المشكلة هي لقاء خلال Aβ ضختحقق من أن قنية الداخلية لا يتم حظر. إذا كان هذا هو الحال، تدفق الماء المقطر المعقم خلال قنية الداخلية. وإذا تم حجب قنية دليل، وتحويل قنية الداخلية في قنية دليل. خلاف ذلك نقل قنية الداخلية صعودا وهبوطا. خلاف في تكبب يمكن أن تكون مرهقة بالنسبة للفئران، وخاصة في اليوم الأول. لتقليل الإجهاد من الحيوان، ونحن نوصي للتلاعب وروض الفئران إلى تكبب قبل الجراحة التجسيمي.
ويمكن أن يعزى العديد من المزايا لهذه الرواية ومرونة في نهج الجسم الحي. والواقع أن طبيعة Aβo ضخت يمكن التحكم بدقة قبل التسريب، ونوع مختلف من الاستعدادات Aβ (على سبيل المثال الاصطناعية مقابل حلول Aβ المستمدة من الدماغ) يمكن حقن لتقييم السمية العصبية في الجسم الحي. ويمكن أيضا أن هذا النموذج أن تستخدم للتحقيق في الآليات التي الأنواع المختلفة Aβ (على سبيل المثال، أحادية، المنخفضة وارتفاع الوزن الجزيئي رأigomers، protofibrils) يمكن أن تحدث التأثيرات السمية العصبية في الجسم الحي، وكيف العلاجات مثل العلاج المناعي قد يقاوم تأثير ضار في الدماغ. منذ ضخ وأداء في مستيقظا، والحيوانات التي تتحرك بحرية، وعدم وجود آثار الخلط بين وكلاء مخدر والحل Aβo على مسارات إشارات، كما هو مبين في الدراسات السابقة. صبغ 32،33 في نقل الحيوانات بحرية وأيضا متوافقة مع الاختبارات السلوكية أي الوقت قبل وبعد الحقن.
دفعات من Aβo وتركيب مضخة يمكن القيام به في الحيوانات من مختلف الأعمار لتحديد آثار Aβo والعلاجات أثناء الشيخوخة. منذ يحدث التنكس العصبي في محيط موقع التسريب، المشبك وفقدان الخلايا العصبية يمكن أن يتسبب في مختلف المناطق والمحلية الدماغ. ضخ جانبية من Aβo والتحكم (سيارة أو التدافع Aβ) يسمح السيطرة على أي تغيير في نفس الحيوان. على العكس من ذلك، Aβo أو السيطرة سولutions يمكن حقن ثنائيا في اليمين واليسار الحصين، على سبيل المثال عند اختبار الحيوانات في المهام السلوكية. ضخ Aβo والعلاج يمكن أن يتم في وقت واحد أو بدلا من ذلك مضخات يمكن تركيبها بعد Aβo ضخ لتقييم ما إذا كان العلاج فعال بعد Aβ الترسيب. ويمكن أيضا أن البروتوكول نفسه هو موضح هنا أن تستخدم عند القيام ضخ intracerebroventricular من Aβo. تأثير Aβo على مسارات الإشارات بين الخلايا يمكن تقييم قبل وبعد فقدان الخلايا العصبية في غضون فترة زمنية قصيرة معقولة. الجرعة وعدد من ضخ Aβ كما يمكن تعديلها للحصول على أكثر أو أقل حدة Aβ المرضية.
على الرغم من شديد التنوع، وهذا الأسلوب له بعض القيود. قنية زرع ينتج اضطراب الميكانيكية للأنسجة وneuroinflammation في الأيام القليلة الأولى بعد الجراحة. وبالتالي، لا بد من الانتظار أسبوع واحد على الأقل بعد عملية جراحية قبل البدء Aβo infuسيون، وإضافة ضوابط سليمة (حقن سيارة أو التدافع غير نشط Aβ) أن تأخذ في الاعتبار هذه الأحداث. أيضا، فقط كمية صغيرة من Aβo يمكن غرست للحد من انتشار الحل.
تمثل مضخات التناضحي وسيلة لتوصيل مريحة وفريدة من نوعها من أجل التحقق من قبل السريرية وكلاء تهدف إلى منع التنكس العصبي الناجم عن Aβ. منذ وقد تبين العلاج المناعي مع الأجسام المضادة 6E10 سابقا لتقليل تراكم Aβ في الدماغ، 31 استخدمنا الأجسام المضادة 6E10 كمفهوم إثبات صحة للتحقق من صحة لدينا في الجسم الحي نهج جديد. وتستخدم مضخات التناضحي في هذا النموذج قد الآن أن تستخدم لتطوير المرض تعديل العلاجات الجديدة التي يمكن أن تمنع ترسب والعصبية من Aβo في المرضى الذين يعانون م ما قبل السريرية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Caroline Bouchard from the animal facility for the rat work. A.S. holds a J.A. De Sève master fellowship, and B.P. a COPSE fellowship from the Université de Montréal This work was funded by grants attributed to J.B. from FRQS-Pfizer and start-up funds from Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal Research Center.
Materials
| Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) | Harvard Apparatus | 59-7316 | |
| PE50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
| Ketamine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bioniche | 1989529 | |
| Xylaxine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bimeda | 8XYL004C | |
| Meloxicam (5 mg/mL) | Norbrook | 215670I01 | |
| Solution of chlorhexidine gluconate 2% and isopropyl alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
| Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
| Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
| ophthalmic ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
| stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
| stereotaxic cannula holder arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
| Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
| Guide Cannula | Plastics one | 326OPG/spc | |
| Injection Cannula | Plastics one | C315I/spc | |
| Dummy Cannula | Plastics one | C315DC/spc | |
| Suture thread coated vicryl rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
| Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
| Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
| 6E10 antibody (mouse IgG1 isotype) | BioLegend | 803003 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | AB18447 | |
| Alzet osmotic pumps model 1007D | Durect corporation | 290 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Amyloid-beta 1-42 | rPeptide | A-1163-1 | |
| Hamilton syringe (10 µL) | Fisher Scientique | 14815279 | |
| Infusion Syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
| Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
| Needle 21G | Terumo | NN-2125R | |
| Snuggle | Lomir Biomedical | RTS04 |
References
- Hardy, J. A., Higgins, G. A. Alzheimer’s disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256, 184-185 (1992).
- Selkoe, D. J. Toward a comprehensive theory for Alzheimer’s disease. Hypothesis: Alzheimer’s disease is caused by the cerebral accumulation and cytotoxicity of amyloid beta-protein. Ann. N.Y. Acad. Sci. 924, 17-25 (2000).
- Terry, R. D., et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer’s disease: synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann. Neurol. 30, 572-580 (1991).
- Giannakopoulos, P., et al. Tangle and neuron numbers, but not amyloid load, predict cognitive status in Alzheimer’s disease. Neurology. 60, 1495-1500 (2003).
- Price, J. L., Morris, J. C. Tangles and plaques in nondemented aging and “preclinical” Alzheimer’s disease. Ann. Neurol. 45, 358-368 (1999).
- Reiman, E. M., et al. Fibrillar amyloid-beta burden in cognitively normal people at 3 levels of genetic risk for Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6820-6825 (2009).
- Aizenstein, H. J., et al. Frequent amyloid deposition without significant cognitive impairment among the elderly. Arch. Neurol. 65, 1509-1517 (2008).
- Mc Donald, J. M., et al. The presence of sodium dodecyl sulphate-stable Abeta dimers is strongly associated with Alzheimer-type dementia. Brain. 133, 1328-1341 (2010).
- Tomic, J. L., Pensalfini, A., Head, E., Glabe, C. G. Soluble fibrillar oligomer levels are elevated in Alzheimer’s disease brain and correlate with cognitive dysfunction. Neurobiol. Dis. 35, 352-358 (2009).
- Naslund, J., et al. Correlation between elevated levels of amyloid beta-peptide in the brain and cognitive decline. JAMA. 283, 1571-1577 (2000).
- Hardy, J. Amyloid double trouble. Nat. Genet. 38, 11-12 (2006).
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 101-112 (2007).
- McLean, C. A., et al. Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer’s disease. Ann. Neurol. 46, 860-866 (1999).
- Hepler, R. W., et al. Solution state characterization of amyloid beta-derived diffusible ligands. Biochemistry. 45, 15157-15167 (2006).
- Martins, I. C., et al. Lipids revert inert Abeta amyloid fibrils to neurotoxic protofibrils that affect learning in mice. EMBO J. 27, 224-233 (2008).
- Lesne, S., et al. A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory. Nature. 440, 352-357 (2006).
- Hung, L. W., et al. Amyloid-beta peptide (Abeta) neurotoxicity is modulated by the rate of peptide aggregation: Abeta dimers and trimers correlate with neurotoxicity. J. Neurosci. 28, 11950-11958 (2008).
- Ono, K., Condron, M. M., Teplow, D. B. Structure-neurotoxicity relationships of amyloid beta-protein oligomers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 14745-14750 (2009).
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 6448-6453 (1998).
- Shankar, G. M., et al. Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer’s brains impair synaptic plasticity and memory. Nat. Med. 14, 837-842 (2008).
- Shankar, G. M., et al. Natural oligomers of the Alzheimer amyloid-beta protein induce reversible synapse loss by modulating an NMDA-type glutamate receptor-dependent signaling pathway. J. Neurosci. 27, 2866-2875 (2007).
- Cleary, J. P., et al. Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function. Nat. Neurosci. 8, 79-84 (2005).
- Townsend, M., Shankar, G. M., Mehta, T., Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Effects of secreted oligomers of amyloid beta-protein on hippocampal synaptic plasticity: a potent role for trimers. J. Physiol. 572, 477-492 (2006).
- Gomez-Isla, T., et al. Profound loss of layer II entorhinal cortex neurons occurs in very mild Alzheimer’s disease. J. Neurosci. 16, 4491-4500 (1996).
- DeKosky, S. T., Scheff, S. W., Styren, S. D. Structural correlates of cognition in dementia: quantification and assessment of synapse change. Neurodegeneration. 5, 417-421 (1996).
- Brouillette, J. The Effects of Soluble Abeta Oligomers on Neurodegeneration in Alzheimer’s Disease. Curr. Pharm. Des. 20, 2506-2519 (2014).
- Brouillette, J., et al. Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-beta1-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model. J. Neurosci. 32, 7852-7861 (2012).
- Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).
- Broersen, K., et al. A standardized and biocompatible preparation of aggregate-free amyloid beta peptide for biophysical and biological studies of Alzheimer’s disease. PEDS. 24, 743-750 (2011).
- Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 4501-4506 (2009).
- Papon, M. A., Whittington, R. A., El-Khoury, N. B., Planel, E. Alzheimer’s disease and anesthesia. Front. Neurosci. 4, 272 (2011).
- Le Freche, H., et al. Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment. Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).
