Altamente sensível e rápido de detecção de fluorescência com um portátil FRET Analyzer
Summary
Este protocolo descreve a quantificação rápida e altamente sensível dos dados do sensor Förster transferência de energia de ressonância (FRET), usando um analisador de FRET portáteis feitos sob medida. O dispositivo foi utilizado para detectar a maltose dentro de uma gama de temperatura crítica que maximiza a sensibilidade de detecção, permitindo a avaliação prática e eficiente do teor de açúcar.
Abstract
As recentes melhorias no Förster transferência de energia de ressonância (FRET) sensores permitiram a sua utilização para detectar várias moléculas pequenas, incluindo íons e aminoácidos. No entanto, a fraca intensidade do sinal dos sensores de FRET inato é um grande desafio que impede a sua aplicação em vários campos e torna o uso de caro, de ponta fluorómetros necessário. Anteriormente, nós construímos, um analisador de FRET relação custo-benefício de alto desempenho que podem especificamente medir a razão de duas bandas de comprimento de onda de emissão (530 e 480 nm) para alcançar alta sensibilidade de detecção. Mais recentemente, descobriu-se que os sensores traste com proteínas de ligação periplasmática bacteriana detectar ligandos com a máxima sensibilidade na gama da temperatura crítica de 50 – 55 ° C. Este relatório descreve um protocolo para avaliar teor de açúcar em amostras de bebidas disponíveis comercialmente usando o nosso analisador FRET portátil com um sensor de FRET específicas de temperatura. Os nossos resultados mostraram que o pré-aquecimento adicionaldo processo do sensor de FRET aumenta significativamente a relação sinal de FRET, para permitir uma medição mais precisa do teor de açúcar. O analisador e o sensor de FRET feito por encomenda foram aplicadas com sucesso para quantificar o teor de açúcar, em três tipos de bebidas comerciais. Prevemos que reforçar ainda mais a redução de tamanho e desempenho do equipamento vai facilitar o uso de analisadores portáteis em ambientes onde o equipamento high-end não está disponível.
Introduction
Förster transferência de energia de ressonância (FRET) tem sido amplamente utilizado como um sensor biométrico para detectar pequenas moléculas tais como os açúcares, os iões de cálcio, e os aminoácidos 1-4. biossensores FRET contêm proteínas fluorescentes, proteínas fluorescentes ciano (CFP) e proteínas fluorescentes amarelas (YFPs), que estão fundidos a ambas as extremidades de proteínas de ligação a periplásmicas (PBPs). Açúcares se ligar a PBP situadas no meio do sensor de FRET, causando alterações estruturais do sensor que, posteriormente, alterar a orientação e a distância transição dipolo das duas proteínas fluorescentes em cada extremidade da PLP. Esta alteração permite uma análise quantitativa do teor de açúcar através da medição da razão entre os comprimentos de onda de emissão de EYFP (530 nm) e ECFP (480 nm). Devido à alta sensibilidade, especificidade, capacidade de monitoramento em tempo real e tempo de resposta rápido de biossensores preocupe, esses sensores são amplamente utilizados em aplicações ambientais, industriais e médicos 5. Além disso, Raciommedição etric utilizando biossensores FRET tem benefícios práticos importantes, uma vez que pode ser utilizada para medir componentes em amostras biológicas complexas, em que a concentração do sensor não pode ser facilmente controlada e a fluorescência de fundo está sempre presente.
Apesar destas vantagens dos sensores baseados em FRET para visualização quantitativa, pequenas mudanças estruturais com domínio incompleta movimento de transferência para as proteínas fluorescentes produzem inerentemente fraca intensidade do sinal. Este sinal fraco limita a aplicação de sensores baseados em FRET para in vitro ou in vivo na análise 6. Consequentemente, a maioria FRET biossensores exigir a utilização de equipamento dispendioso e altamente sensível. Anteriormente, foi desenvolvido um analisador de FRET barato e portátil, com capacidades semelhantes às dos analisadores de fluorescência 7 existentes. Neste dispositivo, de baixo custo 405 nm ultravioleta banda-díodo emissor de luz (LED), foi usada como fonte de luz para excitação de causar thsinal de fluorescência e, a substituição de uma lâmpada ou laser caro. O sistema de detecção do analisador concentra-se eficientemente a dissipação de sinal de fluorescência em dois fotodetectores com um fotodiodo de silício. Num estudo mais recente, que mostrou que a optimização da temperatura de detecção, a 50 – 55 ° C poderia aumentar significativamente o sinal FRET raciométrica 8. Este aumento do sinal específico da temperatura, juntamente com o analisador de FRET feito por medida, permite o uso de sensores de FRET em aplicações de diagnóstico mais gerais com sensibilidade elevada e rápida.
Neste protocolo, demonstramos a aplicabilidade geral do analisador FRET em condições ideais de temperatura FRET por meio da quantificação do teor de açúcar das bebidas disponíveis comercialmente. Este protocolo fornece os detalhes do funcionamento do dispositivo de FRET, bem como uma breve descrição do sensor e a preparação da amostra. Prevemos que este relatório irá promover a aplicação potencial do portátilanalisador em ambientes de laboratório de pequena escala e fornecer uma base para o desenvolvimento de um dispositivo de baixo custo no local de diagnóstico com biosensores baseados em FRET.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo permite a quantificação rápida e eficiente do teor de açúcar em amostras de bebidas, utilizando um feito por medida de FRET analisador de 7 a uma temperatura óptima para sensores de FRET. O analisador foi projetado com um recém-desenvolvido, barato banda de 405 nm de ultravioleta do LED como fonte de luz e dois fotodetectores com um fotodiodo de silício. Este dispositivo é mais rentável do que outras fluorímetros comparáveis. O dispositivo mostrou alta sensibilidade de detecção, e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por doações do Centro de Biologia Sintética Inteligente de Projeto de fronteira global (2011-0031944) e do Programa de Iniciativa KRIBB Research.
Materials
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
References
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
- Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
- Gam, J., Ha, J. -. S., Kim, H., Lee, D. -. H., Lee, J., Lee, S. -. G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
- Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
- Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
- . Fluorescent Protein Guide: Biosensors Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015)
- Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
- Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
- Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
- Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children’s dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
- Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
- Melkko, S., Neri, D., Vaillancourt, P. E. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. , 69-77 (2003).
