Altamente sensible y rápido de detección de fluorescencia con un analizador portátil de FRET
Summary
Este protocolo describe la cuantificación rápida y altamente sensible de Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) datos de sensor utilizando un analizador de FRET portátil a medida. El dispositivo se utilizó para detectar la maltosa dentro de un rango de temperatura crítico que maximiza la sensibilidad de detección, lo que permite la evaluación práctica y eficiente de contenido de azúcar.
Abstract
Las recientes mejoras en la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) sensores han permitido su uso para detectar varias moléculas pequeñas, incluyendo iones y aminoácidos. Sin embargo, la intensidad de señal débil innata de sensores FRET es un reto importante que impide su aplicación en diversos campos y hace que el uso de los caros, de alta gama fluorómetros necesario. Anteriormente, hemos construido un analizador de FRET de alto rendimiento rentable que puede medir específicamente la relación de dos bandas de longitud de onda de emisión (530 y 480 nm) para lograr una alta sensibilidad de detección. Más recientemente, se descubrió que los sensores FRET con las proteínas de unión periplásmicas bacterianas detectar ligandos con una sensibilidad máxima en el rango de temperatura crítica de 50 – 55 ° C. Este informe describe un protocolo para evaluar el contenido de azúcar en muestras de bebidas disponibles en el mercado utilizando nuestro analizador de FRET portátil con un sensor FRET-temperatura específica. Nuestros resultados mostraron que el precalentamiento adicionalproceso del sensor FRET aumenta significativamente la señal de relación de FRET, para permitir la medición más precisa de contenido de azúcar. El analizador y el sensor FRET medida se han aplicado con éxito para cuantificar el contenido de azúcar en tres tipos de bebidas comerciales. Anticipamos que mejora aún más la reducción del tamaño y el rendimiento de los equipos va a facilitar el uso de analizadores portátiles en entornos en los equipos de gama alta no está disponible.
Introduction
Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) se ha utilizado ampliamente como un sensor biométrico para detectar moléculas pequeñas tales como azúcares, iones de calcio, y los aminoácidos 1-4. biosensores FRET contienen proteínas fluorescentes, proteínas fluorescentes cian (CFP), y proteínas fluorescentes amarillas (YFPs), que están condensados a ambos extremos de proteínas de unión periplásmicas (PBP). Los azúcares se unen a las PBP ubicadas en el medio del sensor FRET, causando cambios estructurales en el sensor que posteriormente altera la orientación y distancia de transición de dipolo de las dos proteínas fluorescentes en cada extremo de la PBP. Este cambio permite el análisis cuantitativo de contenido de azúcar mediante la medición de la relación de las longitudes de onda de emisión de EYFP (530 nm) y ECFP (480 nm). Debido a la alta sensibilidad, la especificidad, la capacidad de monitorización en tiempo real, y rápido tiempo de respuesta de los biosensores FRET, estos sensores son ampliamente utilizados en aplicaciones medioambientales, industriales, médicas y 5. Por otra parte, ratiommedición etric utilizando biosensores FRET tiene importantes beneficios prácticos, ya que puede ser usado para medir componentes en muestras biológicas complejas en las que la concentración de sensor no se puede controlar fácilmente y la fluorescencia de fondo está siempre presente.
A pesar de estas ventajas de los sensores basados en FRET para la visualización cuantitativa, los pequeños cambios estructurales con dominio incompleto de movimiento de transferencia de las proteínas fluorescentes producen una intensidad de señal inherentemente débil. Esta señal débil limita la aplicación de sensores basados en FRET para el análisis in vitro o in vivo en 6. En consecuencia, la mayoría FRET biosensores requieren el uso de equipos costosos y altamente sensible. Anteriormente, hemos desarrollado un analizador de FRET barato y portátil con capacidades similares a las de los analizadores de fluorescencia existentes 7. En este dispositivo, de bajo costo, de 405 nm banda ultravioleta diodo emisor de luz (LED) se utilizó como fuente de luz para provocar la excitación de THseñal de fluorescencia e, en sustitución de una lámpara o láser caro. El sistema de detección del analizador se centra de manera eficiente la señal de fluorescencia de disipación en dos fotodetectores con un fotodiodo de silicio. En un estudio más reciente, se demostró que la optimización de la detección de la temperatura a 50 – 55 ° C podría ampliar significativamente la señal de FRET radiométrica 8. Esta mejora de la señal-temperatura específica, junto con el analizador de FRET a medida, permite el uso de sensores FRET en aplicaciones de diagnóstico más generales con la rápida y alta sensibilidad.
En este protocolo, hemos demostrado la aplicabilidad general del analizador de FRET en condiciones óptimas de temperatura FRET mediante la cuantificación del contenido de azúcar de las bebidas disponibles en el mercado. Este protocolo proporciona los detalles de la operación del dispositivo FRET, así como una breve descripción de sensor y preparación de la muestra. Anticipamos que este informe promueva la aplicación potencial de la portátilanalizador en entornos de laboratorio a pequeña escala y proporcionar una base para el desarrollo de un dispositivo de diagnóstico de bajo costo en el lugar con biosensores basados en FRET.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo permite la cuantificación rápida y eficiente del contenido de azúcar en las muestras de bebidas, utilizando un analizador de FRET a medida 7 a una temperatura óptima para sensores FRET. El analizador se ha diseñado con un LED ultravioleta de bajo costo banda de 405 nm recientemente desarrollado como fuente de luz y dos fotodetectores con un fotodiodo de silicio. Este dispositivo es más rentable que otros fluorómetros comparables. El dispositivo mostró alta sensibilidad de detección, es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por las subvenciones del Centro de Biología sintética inteligente del Proyecto Global Frontier (2011 a 0.031.944) y el Programa de Iniciativa de Investigación KRIBB.
Materials
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
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