רגיש מאוד מהיר קרינת איתור עם Analyzer Portable סריג
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הכימות המהיר ורגיש מאוד של העברת אנרגית תהודת פורסטר נתוני חיישנים (סריג) באמצעות נתח סריג נייד מחוייט. המכשיר שימש לאיתור מלטוז בטווח טמפרטורה קריטית הממקסם רגישות זיהוי, שמאפשרים להעריך מעשית ויעילה של תכולת הסוכר.
Abstract
שיפורים שנעשו לאחרונה תהודה העברת אנרגיה פורסטר חיישנים (סריג) אפשרו את השימוש בהם כדי לזהות מולקולות קטנות שונות כולל יונים וחומצות אמינו. עם זאת, את עוצמת האות החלשה המולד של חיישני סריג הוא אתגר גדול שמונע בקש בתחומים שונים והופך את השימוש יקר, high-end fluorometers צורך. בעבר, בנינו מנתח סריג חסכוני, בעל ביצועים גבוהים שיכול למדוד את היחס במיוחד של שתי להקות אורך גל פליטה (530 ו -480 ננומטר) כדי להשיג רגישות זיהוי גבוהה. לאחרונה, התגלה כי חיישני סריג עם חלבונים מחייבים periplasmic חיידקי לזהות הליגנדים ברגישות המקסימלית בטווח הטמפרטורה הקריטי של 50 – 55 מעלות צלזיוס. דו"ח זה מתאר פרוטוקול להערכת תכולת הסוכר בדגימות משקות, זמינות מסחרי באמצעות מנתח הסריג הנייד שלנו עם חיישן טמפרטורת סריג ספציפי. התוצאות שלנו הראו כי preheating הנוסףתהליך של חיישן הסריג מגביר באופן משמעותי את אות יחס הסריג, כדי לאפשר מדידה מדויקת יותר של תכולת סוכר. מנתח הסריג מחוייט החיישן יושמו בהצלחה לכמת את תכולת הסוכר בשלושה סוגים של משקאות מסחריים. אנו צופים כי שיפור ביצועים והקטנת גודל נוסף של הציוד יקל על שימוש מנתחי כף יד בסביבות שבן ציוד high-end אינו זמין.
Introduction
אנרגית העברת תהודת פורסטר (סריג) כבר בשימוש נרחב כחיישן ביומטרי לזיהוי מולקולות קטנות כגון סוכרים, יוני סידן, וחומצות אמינו 1-4. biosensors סריג מכילים חלבוני ניאון, חלבוני ניאון ציאן (CFPs), וחלבונים פלואורסצנטי צהוב (YFPs), אשר התמזגו בשני הקצוות של חלבונים קושרי periplasmic (PBPs). סוכרים להיקשר PBPs ממוקם באמצע חיישן סריג, ולגרום לשינויים מבניים לחיישן כי לאחר מכן לשנות את כיוון דיפול מרחק המעבר של שני חלבוני ניאון בכל צד של PBPs. שינוי זה מאפשר ניתוח כמותי של תכולת הסוכר על ידי מדידת היחס בין אורכי גל הפליטה של EYFP (530 ננומטר) ECFP (480 ננומטר). בזכות הרגישות, סגוליות גבוהה, יכולת ניטור בזמן אמת, וזמן תגובה מהיר של חיישנים ביולוגיים סריג, חיישנים אלה נמצאים בשימוש נרחב ביישומים הסביבה, תעשייה, רפואה 5. יתר על כן, ratiomמדידת etric באמצעות חיישנים ביולוגי סריג יש יתרונות מעשיים חשובים, כפי שהוא יכול לשמש כדי למדוד רכיבים בדגימות ביולוגיות מורכבות שבו ריכוז החיישן לא ניתן לשלוט בקלות קרינת רקע הוא תמיד נוכחת.
למרות יתרונות אלה של חיישנים מבוססים סריג להדמיה כמותית, שינויים מבניים קטנים עם העברת תנועת תחום שלם אל חלבוני הניאון לייצר עוצמת אות חלשה מטבעו. אות חלש זה מגביל את היישום של חיישנים מבוססי סריג עבור במבחנה או in vivo ניתוח 6. כתוצאה מכך, רוב הסריג biosensors דורש שימוש בציוד יקר ורגיש מאוד. בעבר, פתחנו מנתח סריג זול ונייד עם יכולות דומות לאלה של מנתחי הקרינה הקיימים 7. במכשיר זה, דיודה האור האולטרה סגול הלהקה 405 ננומטר זולה (LED) שימש כמקור האור לגרום עירור של הדואר אותות הקרינה, החלפת מנורה או לייזר יקר. מערכת זיהוי של הנתח ביעילות מתמקדת אות הקרינה שמגרש גבי שני photodetectors עם פוטודיודה סיליקון. במחקר שנערך לאחרונה יותר, הראינו כי אופטימיזציה של טמפרטורת זיהוי ב 50 – C ° 55 יכולה משמעותית להגדיל את אות סריג ratiometric 8. טמפרטורה ספציפית זה שיפור אות, יחד עם מנתח מחוייט הסריג, מאפשר שימוש חיישני סריג ביישומי אבחון כלליים יותר ברגישות מהירה וגבוהה.
בפרוטוקול זה, הראינו את תחולתה הכללית של הנתח סריג בתנאי טמפרטורה סריג אופטימלי על ידי כימות שתכולת הסוכר משקאות זמינים מסחרית. פרוטוקול זה מספק את הפרטים של פעולת מכשיר סריג, וכן תיאור קצר של חיישן הכנת מדגם. אנו צופים כי דו"ח זה יקדם את התחולה הפוטנציאלית של ניידמנתח בסביבות מעבדה בקנה מידה קטן לספק בסיס להמשך פיתוח של מכשיר אבחון באתר זול עם חיישנים ביולוגיים מבוססי סריג.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מאפשר כימות מהיר ויעיל של תכולת הסוכר בדגימות משקות, באמצעות נתח מחוייט סריג 7 בטמפרטורה אופטימלית עבור חיישני סריג. המנתח נועד עם א-שפותח לאחרונה, להקת 405 ננומטר זול אולטרה סגול-LED כמקור האור ושני photodetectors עם פוטודיודה סיליקון. מכשיר זה הוא יותר יעיל ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי מענקים ממרכז ביולוגית Intelligent הסינטטי של פרויקט Frontier גלובל (2011-0031944) ותכנית יוזמת מחקר KRIBB.
Materials
| LB | BD | #244620 | |
| isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma | I6758 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Tri-HCl | Bioneer | C-9006-1 | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| EDTA | Bioneer | C-9007 | |
| DTT | Sigma | D0632 | |
| NaCl | Junsei | 19015-0350 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
| SOC | 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose | ||
| Resource Q | Amersham Biosciences | 17-1177-01 | 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column |
| HisTrap HP1 | Amersham Biosciences | 29-0510-21 | |
| Quartz cuvette | Sigma | Z802875 | |
| AKÄKTAFPLC | Amersham Biosciences | 18-1900-26 | a fast protein liquid chromatography (FPLC) |
| Cary Eclipse | VarianInc | a fluorescence spectrophotometer | |
| VICTOR | PerkinElmer | 2030-0050 | a multilabel plate reader |
| E. coli JM109 (DE3) | Promega | Electrocompetent cells | |
| A (Beverage) | Korea Yakult Co. (Korea) | Birak | Fermented drinks |
| B (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Epro | Soft drink |
| C (Beverage) | Lotte Foods (Korea) | Getoray | Sports drink |
References
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
- Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
- Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
- Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
- Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
- Gam, J., Ha, J. -. S., Kim, H., Lee, D. -. H., Lee, J., Lee, S. -. G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
- Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
- Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
- . Fluorescent Protein Guide: Biosensors Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015)
- Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
- Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
- Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
- Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children’s dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
- Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
- Melkko, S., Neri, D., Vaillancourt, P. E. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. , 69-77 (2003).
