ポータブルFRETアナライザを使用して高感度かつ迅速な蛍光検出

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）が広く、糖、カルシウムイオン、およびアミノ酸^1-4のような小分子を検出するための生体センサとして使用されてきました。 FRETバイオセンサーは、ペリプラズム結合タンパク質（のPBP）の両末端に融合される蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質（CFPS）、および黄色蛍光タンパク質（YFPs）を含みます。糖は、その後のPBPの両端にある2つの蛍光タンパク質の距離と遷移双極子の向きを変化させるセンサに構造変化を引き起こし、FRETセンサーの中央に位置するのPBPに結合します。この変更は、EYFP（530 nm）をECFP（480 nm）での発光波長の比を測定することにより、糖度の定量分析を可能にします。高い感度、特異性、リアルタイムの監視能力、及びFRETバイオセンサーの速い応答時間のために、これらのセンサが広く、環境産業、および医療用途⁵で使用されています。また、ratiomセンサー濃度を容易に制御することができず、バックグラウンド蛍光が常に存在する複雑な生物学的試料中の成分を測定するために使用することができるようにFRETバイオセンサーを用いてetric測定は、重要な実用上の利点を有しています。

定量的な可視化のためのFRETベースのセンサのこれらの利点にもかかわらず、蛍光タンパク質の不完全なドメイン動き転送に小さな構造的変化は、本質的に弱い信号強度を生成します。この弱い信号は、 インビトロまたはインビボ分析 ⁶ に FRETベースのセンサの適用を制限します。その結果、ほとんどのFRETバイオセンサーは高価で高感度な装置の使用を必要とします。以前、我々は、既存の蛍光分析装置⁷と同様の機能を備えた安価なポータブルFRET分析装置を開発しました。この装置では、安価な405 nmの帯域紫外発光ダイオード（LED）は、目の励振を引き起こすために、光源として使用されました電子蛍光シグナル、高価なランプまたはレーザーを置き換えます。分析装置の検出システムは、効率的にシリコンフォトダイオードを有する2つの光検出器上に放熱蛍光信号を集束させます。 55°C大幅レシオメトリックFRETシグナル^8を拡大できた-より最近の研究では、50の検出温度の最適化があることを示しました。この温度固有のシグナル増強は、カスタムメイドのFRETアナライザと一緒に、迅速かつ高感度で、より一般的な診断用途でのFRETセンサーの使用を可能にします。

このプロトコルでは、我々は、商業的に入手可能な飲料の糖含有量を定量することにより、最適なFRET温度条件下FRET解析の一般的な適用可能性を実証しました。このプロトコルは、FRETデバイス動作の詳細、ならびにセンサーおよび試料調製の簡単な説明を提供します。我々は、この報告書は、ポータブルの潜在的な適用を促進することを期待します小規模な実験室環境でのアナライザとFRETベースのバイオセンサーと安価なオンサイト診断装置のさらなる発展のための基盤を提供します。