Methoden zur Untersuchung MRP4- haltigen Makromolekulare Komplexe in der Verordnung von Fibroblast Migration

Die Zellmigration ist ein kompliziertes Mehrstufenverfahren. Studien haben gezeigt, dass sich bei der Migration Zellen polarisiert in Vorder- und Hinterkanten. Durch die Einhaltung der extrazellulären Matrix stellt die Vorderkante die Traktion, die für die Zellkörper nach vorne zu bewegen. Schließlich rundet die Hinterkante Releases Nachläufer und den Migrationszyklus ^1,2.

Zellpolarisation für eine effiziente Zellmigration wird durch räumliche Trennung von intrazellulären Signal geregelt. Cellular second messenger wie cAMP, vermitteln die Kompartimentierung der Signalereignisse , die für fein abgestimmte Richtungszellmigration ^3,4. Bevorzugte Ansammlungen von cAMP und cAMP-abhängige Kinase PKA – Aktivität an der Vorderkante spielen Schlüsselrollen in Richtungszellmigration ^5,6. Durch phosphorylating kleinen GTPasen wie Ras-bezogene C3 Botulinumtoxin Substrat (rac) und Zellteilungskontrollprotein 42 Homolog oder Cdc42, PKA aktiviert Aktin-verwandtes Protein 2/3 (Arp 2/3) an der Vorderkante und induziert die Bildung von Lamellipodien ^7-9. PKA phosphoryliert auch eine anti-capping agent, stimuliert Vasodilatator Phosphoprotein (VASP), wodurch der ^10,11 Schwingungszyklen von Membran Ausfahren und Einziehen steuert.

In den Zellen werden die cAMP – Spiegel durch drei wesentliche Prozesse geregelt: i) Synthese von Adenylatcyclase, ii) Abbau durch Phosphodiesterasen, und iii) Transport von membrangebundenen Efflux – Transporter ^3. Multidrug resistance protein 4 (MRP4), ein Mitglied der ATP-bindende-Kassette (ABC) Familie von Membrantransportern, Funktionen als endogene Effluxtransporter cyclischer Nucleotide. Daher kann MRP4- intrazellulären cAMP – Spiegel regulieren und cAMP-abhängige zelluläre Signalgebung ^13.11. Schneller c enthalten relativ höhere zyklische Nukleotide, Fibroblasten und wandern ^{– / –} Wir haben das in MRP4- zuvor gezeigt ,ompared zu MRP4 ^{+ / + 14} – Fibroblasten. Wir berichteten auch eine zweiphasige Wirkung zyklischer Nukleotide auf Fibroblasten-Migration. Basierend auf früheren Studien und unsere Feststellung , daß MRP4 ^{– / –} Fibroblasten im Verlauf der Migration polarisierter cAMP enthalten, die Hypothese aufgestellt , dass diese MRP4-vermittelte Regulation der Fibroblasten – Migration ist cAMP abhängig. Um den nachgeschalteten Mechanismus zu verstehen, haben wir einen direkten noch mehrdimensionalen Ansatz.

Um die Proteine ​​im Zusammenhang und im Zusammenspiel mit MRP4- identifizieren, immunpräzipitierten wir MRP4- enthaltende makromolekulare Komplexe aus HEK293-Zellen, die über MRP4- auszudrücken. Mit Massenspektrometrie identifizierten wir mehrere MRP4–interagierende Proteine ​​und analysiert, um ihre Vernetzung mit Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA ist ein nützliches Werkzeug Protein-Protein-Wechselwirkungen (sowohl strukturelle als auch funktionelle) und erkunden ihre Beiträge insbesondere physiologischen und pathologischen AnalyseEreignisse auf der Grundlage der Literatur und experimentelle Beweise ^15,16. IPA zeigte , dass F-Aktin ein Hauptziel von Downstream MRP4 im Rahmen der Zellmigration ist , wo cAMP und cGMP die Schlüssel sind Signalmoleküle ^17. Diese Daten wurden weiter bestätigt durch High-Content-Mikroskopie. High-Content – Mikroskopie kann die Zell Verhaltensweisen wie Zellmigration in eine bequemere, präzise und mit hohem Durchsatz ¹⁸ Art und Weise zu erfassen und zu analysieren. Die High-Content – Mikroskopie Daten zeigten , dass die Wirkung von MRP4 auf Fibroblasten – Migration vollständig auf Unterbrechung des Actin – Cytoskeletts oder Hemmung von PKA ¹⁷ aufgehoben wird.

Darüber hinaus haben wir ein Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) -basierte PKA Sensor die PKA Dynamik bei der Migration von Zellen in Echtzeit zu überwachen. FRET-Kinase – Sensoren bestehen meist aus spezifischen Phosphorylierungssubstrat Peptiden flankiert von CFP und YFP Fluorophore ^19-21. pmAKAR3 ist eine verbesserte und michmbrane gezielte FRET-basierten PKA – Sensor, der forkhead-assoziierte Domäne 1 (FHA1) und der PKA Substratsequenz LRRATLVD ^5,22 enthält. Die Phosphorylierung von pmAKAR3 durch die PKA katalytische Untereinheit erhöht FRET – Signals zwischen CFP und YFP ^19. Insertion einer Lipidmodifikation Bereich in den Sensor richtet es an die Plasmamembran für PKA Dynamik überwacht wird , speziell an der Membrankammer ²³ auf .

Mit pmAKAR3 haben wir gezeigt , dass die Vorderkante MRP4- der Migration ^{– / –} Fibroblasten zeigten mehr polarisiert PKA – Aktivität als MRP4- ^{+ / +} Fibroblasten, was wiederum die kortikalen Aktin Formation ¹⁷ an der Zelle Vorderkante erhöht. Zusammen führten diese Ereignisse zu einer besseren zellulären Polarisation und schnellere Richtungszellmigration in Abwesenheit von MRP4-. Unsere spezifischen und direkten Ansatz Schlüssel nachgelagerten Ziele für MRP4- identifiziert und stellt eine wichtige, aber wieaus bislang unerforschten Mechanismus für MRP4–abhängige Regulation von Fibroblasten-Migration.