Methoden om-MRP4 bevattende macromoleculaire complexen studie in de verordening van fibroblast migratie

Celmigratie is een ingewikkeld proces van meerdere stappen. Studies hebben aangetoond dat tijdens migratiecellen gepolariseerd in voorste en achterste randen. Door vast te houden aan de extracellulaire matrix, de leading edge levert de tractie nodig zijn voor de cel lichaam om vooruit te komen. Tot slot, de achterrand releases achter bijlagen en completeert de migratie cyclus ^1,2.

Cel polarisatie voor een efficiënte celmigratie wordt gereguleerd door ruimtelijke segregatie van intracellulaire signalering. Cellulaire tweede messengers, zoals cAMP, bemiddelen de compartimentering van de signalering gebeurtenissen die nodig zijn voor fine-tuned directionele celmigratie ^3,4. Preferentiële ophopingen van cAMP en cAMP-afhankelijke kinase PKA activiteit op de voorrand een belangrijke rol spelen in directionele celmigratie ^5,6. Door fosforylatie kleine GTPases zoals Ras-gerelateerde C3 botulinum toxine substraat (Rac) en celdeling controle-eiwit 42 homoloog of Cdc42, PKEen activeert actine-gerelateerd eiwit 2/3 (Arp 2/3) aan de voorste rand en induceert de vorming van lamellipodia ^7-9. PKA fosforyleert ook een anti-capping middel, vaatverwijdende gestimuleerd fosfoproteïne (VASP), waardoor regelt de oscillerende cycli van membraan uitbreiding en intrekken ^10,11.

In cellen, zijn cAMP niveaus geregeld door drie belangrijke processen: i) synthese door adenylaatcyclase, ii) degradatie door fosfodiësterasen, en iii) het vervoer door membraangebonden transporters ^3. Multidrug resistentie eiwit 4 (MRP4), een lid van de ATP-bindende cassette (ABC) familie van membraantransporteiwitten, functioneert als een endogene effluxtransporter van cyclische nucleotiden. Daarom kan MRP4 intracellulaire cAMP niveaus reguleren en cAMP-afhankelijke cellulaire signalering ^11-13. We hebben eerder aangetoond dat MRP4 ^{– / –} fibroblasten bevatten relatief hogere niveaus van cyclische nucleotiden en migreren sneller compared tot MRP4 ^{+ / +} fibroblasten ^14. Ook rapporteerde een bifasisch effect van cyclische nucleotiden op fibroblastmigratie. Op basis van eerdere studies en onze bevinding dat MRP4 ^{– / –} fibroblasten bevatten meer gepolariseerd cAMP tijdens migratie veronderstelden we dat MRP4-gemedieerde regulering van de fibroblast migratie cAMP afhankelijke. Om de stroomafwaartse mechanisme te begrijpen, hebben we een directe nog veelzijdige benadering.

Om de eiwitten in verband en in samenspel met MRP4 identificeren, we immunogeprecipiteerd-MRP4 bevattende macromoleculaire complexen uit HEK293 cellen die overexpressie MRP4. Met behulp van massaspectrometrie, we geïdentificeerd multiple-MRP4 interactie eiwitten en hun interconnectiviteit geanalyseerd met behulp van Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA is een nuttig instrument om eiwit-eiwit interacties (zowel structurele en functionele) te analyseren en hun bijdragen in het bijzonder fysiologische en pathologische verkennenevents op basis van de literatuur en experimentele bewijzen ^15,16. IPA vermeld dat F-actine is een belangrijke doelstelling van MRP4 stroomafwaarts in de context van celmigratie waarbij cAMP en cGMP zijn de belangrijkste signaalmoleculen ^17. Deze gegevens werden verder bevestigd door een hoge gehalte microscopie. High-inhoud microscopie kan vastleggen en analyseren van cel gedrag, zoals cel migratie in een handiger, nauwkeuriger en high-throughput wijze ^18. De high content microscopie gegevens tonen dat het effect van MRP4 op fibroblastmigratie volledig ingetrokken na verstoring van de actine cytoskelet of remming van PKA ^17.

Daarnaast gebruikten we een Förster resonantie energieoverdracht (FRET) gebaseerde PKA sensor om de PKA dynamiek monitoren migrerende cellen in real time. -FRET gebaseerde kinase sensoren bestaan ​​meestal uit specifieke fosforylering substraat peptiden geflankeerd door GVB en YFP fluoroforen ^19-21. pmAKAR3 is een verbeterde en mijmbrane gerichte FRET-gebaseerde PKA sensor die-forkhead bijbehorende domein 1 (FHA1) en de PKA substraat sequentie LRRATLVD ^5,22 bevat. Fosforylering van pmAKAR3 door de PKA katalytische subunit toeneemt FRET signaal tussen GVB en YFP ^19. Insertie van een lipide wijzigingsdomein in sensor richt naar de plasmamembraan toezicht PKA dynamiek, specifiek op het membraancompartiment ^23.

Gebruik pmAKAR3 hebben we aangetoond dat de voorrand van het migreren MRP4 ^{– / –} fibroblasten vertoonden polarisatie PKA activiteit dan MRP4 ^{+ / +} fibroblasten, waardoor de vorming corticale actine in de cel voorrand ¹⁷ verhoogd. Samen vormen deze gebeurtenissen resulteerde in betere cellulaire polarisatie en sneller gerichte celmigratie in de afwezigheid van MRP4. Onze specifieke en directe aanpak geïdentificeerd belangrijke downstream targets voor MRP4 en vormt een belangrijke, maar alsnog van onontgonnen mechanisme voor MRP4-afhankelijke regulering van de fibroblast migratie.