Yöntemler Fibroblast Göç Yönetmeliği Mrp4 içeren makromoleküler kompleksler Eğitim için
Summary
MRP4 hücre göçü bir süre önce aydınlatılmamıştır rolü dahil olmak üzere çeşitli siklik nükleotid-bağımlı sinyal olaylarını düzenler. Biz fibroblast göçü ince ayar düzenlenmesinde önemli roller oynamaktadır benzersiz MRP4 interaktom belirlenmesi ile sonuçlanan MRP4 aşağısında moleküler hedeflerin çözülmeye doğrudan, ama çok yönlü bir yaklaşım açıklar.
Abstract
Çoklu ilaç direnci proteini 4 (MRP4) membran taşıyıcılarının ATP-bağlayıcı kaset ailesinin bir üyesi olan ve siklik nükleotidin bir endojen akış taşıyıcıdır. intraselüler siklik nükleotid konsantrasyonunun modüle edilmesiyle, MRP4 hücre göçü de dahil olmak üzere birden fazla, siklik nükleotid-bağımlı hücresel olayları ayarlayabilir. Daha önce, MRP4 yokluğunda fibroblast hücreleri, hücre içi siklik nükleotidlerin yüksek seviyelerini ihtiva edebilmekte ve daha hızlı göç göstermiştir. Bu bulgunun altında yatan mekanizmaları anlamak için, biz doğrudan ama çok yönlü bir yaklaşım benimsemiştir. İlk olarak, kütle spektrometresi, ardından imüno kullanılarak MRP4 aşırı ifadesi hücre sistemi için MRP4 potansiyel etkileşimli protein kompleksleri izole edilmiştir. MRP4 interaktom benzersiz proteinleri tanımlamak sonra sinyal iletimi kapsamında bu protein-protein etkileşimlerinin rolünü araştırmak için Ingenuity Pathway Analizi (IPA) kullanılmıştır. Biz po aydınlatılamamıştırHücre göçü üzerinde MRP4 etkisinin önemli bir aracısı olarak hücre göçü MRP4 protein kompleksinin ve tespit edilen F-aktin aşamasında potansiyel rolü. Bu çalışma aynı zamanda göçmen olayların kilit oyuncular olarak cAMP ve cGMP rolünü vurguladı. yüksek içeriği mikroskobu kullanarak, hücre göçü deneyleri gerçekleştirilmiştir ve fibroblast göçü üzerinde MRP4 etkisi tamamen cAMP bağımlı kinaz A (PKA), aktin hücre iskeletinin veya inhibisyon bozulması sonucu yok olduğunu gözlemledik. Gerçek zamanlı bir göç hücrede modülasyon sinyal görselleştirmek için, biz PKA aktivitesini ölçmek için bir FRET tabanlı sensör kullanmış ve buldum, Mrp4 göç ön kenarına yakın daha kutuplaşmış PKA aktivitesinin varlığı – / – karşılaştırıldığında fibroblast, Mrp4 + / fibroblastlar +. Bu da kortikal aktin oluşumunu artmış ve göç sürecini artar. Yaklaşımımız MRP4 için aşağı hareket proteinlerin tanımlanmasını sağlar ve bir over bize sunuyorfibroblast göçü MRP4 bağımlı düzenlenmesinde rol oynayan mekanizmanın görünümü.
Introduction
Hücre göçü karmaşık bir çoklu-aşamalı bir işlemdir. Çalışmalar göç hücreleri sırasında baştaki ve sondaki kenarları içine polarize olduğunu göstermiştir. hücre gövdesi ileriye taşımak için ekstraselüler matriks kalarak, öncü gerekli çekiş gücü sağlar. Son olarak, kenar serbest bırakır arka arka ekleri ve göç döngüsü 1,2 tamamlar.
verimli hücre göçü için hücre polarizasyon hücre içi sinyal mekansal ayrışma ile düzenlenir. Böyle cAMP gibi hücresel ikinci haberciler, ince ayarlı yönlü hücre göçü 3,4 için gerekli sinyal olaylarının compartmentalization aracılık eder. Lider kenarında cAMP ve cAMP bağımlı kinaz PKA aktivitesinin Tercihli birikimleri yönlü hücre migrasyonu 5,6 anahtar rol oynarlar. ras ile ilgili C3 botulinum toksini alt-tabaka (rac) ve hücre bölünmesi kontrol proteini 42 homolog ya da Cdc42, PK küçük GTPazlar fosforilleyerekÖnde gelen kenarında aktin-ilişkili protein 2/3 (Arp 2/3) aktive eder ve lamellipodia 7-9 oluşumunu uyarır. PKA, aynı zamanda, bir anti-başlık ajanı, fosforile, damar genişletici ve böylece membran uzatma ve geri çekme 10,11 salınım döngüsü düzenler, fosfoprotein (VASP) uyarılır.
Zara-bağlı akış taşıyıcı 3 I) Sentez adenilat siklaz, fosfodiesterazlar II) bozulması ve iii) taşıma ile: hücrelerde, cAMP seviyelerinin üç ana işlemler ile düzenlenmektedir. Çoklu ilaç direnci proteini 4 (MRP4), siklik nükleotidlerin endojen akış taşıyıcısı olarak membran ileticileri, fonksiyonların ATP-bağlayıcı kaset (ABC) ailesinin bir üyesidir. Bu nedenle, MRP4 hücre içi cAMP seviyelerini düzenleyen ve cAMP bağımlı hücre 11-13 sinyal. – / -, Fibroblastlar, siklik nükleotidlerin göreceli olarak daha yüksek seviyede içeren ve hızlı c geçiş Daha önce Mrp4 göstermiştir kiMrp4 + / + fibroblastlar 14 ompared. Biz de fibroblast göçü üzerinde döngüsel nükleotidlerin bifazik etki bildirdi. Önceki çalışmalara dayanarak ve Mrp4 bizim bulgu – / – fibroblastlar göç sırasında daha kutuplaşmış cAMP içeren fibroblast göçü bu MRP4 aracılı düzenleme cAMP bağımlı olduğunu varsaydık. aşağı mekanizmasını anlamak için, biz doğrudan ama çok yönlü bir yaklaşım aldı.
ilişkili ve MRP4 ile etkileşim içinde proteinleri tespit etmek, biz üzerinden MRP4 ifade HEK293 hücrelerinden MRP4 içeren makromoleküler kompleksleri immünopresipitasyon. kitle spektrometresi kullanarak, birden fazla MRP4-etkileşim proteinleri tespit ve Yaratıcılık Yolu Analizi (IPA) kullanarak birleştiricisi analiz edildi. IPA (yapısal ve fonksiyonel hem de), protein-protein etkileşimleri analiz ve özellikle fizyolojik ve patolojik olarak katkılarını araştırmak için bir araçtıredebiyat ve deneysel kanıtlara 15,16 dayalı olaylar. IPA cAMP ve cGMP molekülleri 17 anahtar sinyal olduğu F-aktin hücre göçü bağlamında MRP4 önemli bir alt hedef olduğunu göstermiştir. Bu veriler ayrıca, yüksek içeriği mikroskopisi ile teyit edilmiştir. Yüksek içerik mikroskopi yakalamak ve daha uygun, doğru ve yüksek verimli bir şekilde 18 gibi hücre göçü gibi hücre davranışlarını analiz edebilirsiniz. Yüksek içerik mikroskopi veri fibroblast göçü üzerinde MRP4 etkisi tamamen PKA 17 aktin hücre iskeletinin veya inhibisyon bozulması üzerine kaldırılmıştır olduğunu göstermiştir.
Ayrıca, bir Förster rezonans enerji transferi (FRET) gerçek zamanlı olarak hücrelerin göç PKA dinamiklerini izlemek için PKA sensör tabanlı kullanılır. FRET tabanlı kinaz sensörleri genellikle CFP ve YFP fluorophores 19-21 çevrili özel fosforilasyon substrat peptidler oluşur. pmAKAR3 geliştirilmiş ve bana olanmbrane forkhead ilişkili alan 1 (FHA1) ve PKA substrat sekansını LRRATLVD 5,22 ihtiva FRET göre PKA sensörü hedef almıştır. PKA, katalitik alt birim artışlar pmAKAR3 fosforilasyonu CFP ve YFP 19 arasındaki sinyali FRET. Sensöre bir lipit modifikasyonu etki yerleştirilmesi özellikle zar bölmesi 23, PKA dinamiklerini izlemek için plazma membran bunu hedefliyor.
PmAKAR3 kullanarak, göstermiştir ki Mrp4 göç öncü – / – sırayla hücrenin hücum kenarı 17 kortikal aktin oluşumunu artmış Mrp4 + / + fibroblastlar, daha kutuplaşmış PKA aktivite sergiledi fibroblastlar. Birlikte, bu olaylar MRP4 yokluğunda daha iyi hücresel kutuplaşma ve daha hızlı yön hücre göçü sonuçlandı. Bizim özel ve doğrudan bir yaklaşım MRP4 için anahtar aşağı hedefler belirledik ve önemli bir sağlar, ancakfibroblast göçü MRP4 bağımlı düzenleme için henüz keşfedilmemiş bir mekanizma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell migration is an intricate process that plays indispensable roles in many important physiological events including wound healing1,2. Aberrant cell migrations may cause catastrophic events, such as tumor metastasis and angiogenesis24,25. Therefore, fine-tuned regulation of cell migration is required to maintain normal body function.
Using high-content microscopy18, we demonstrated that MRP4-deficient MEFs migrate faster compared to wild-type fibroblasts…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants R01-DK080834 and R01-DK093045. We thank J. Denise Wetzel, CCHMC Medical Writer, for editing of the manuscript.
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 11668-027 | |
| DMEM | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11965-092 | |
| IncuCyte Zoom | Essen BioScience | ||
| 96-well IncuCyte Image-Lock microplates | Essen BioScience | 4493 | |
| Latrunculin B | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | L5288 | Stock in DMSO |
| H-89 | Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY) | BML-EI196 | Stock in DMSO |
| 35-mm glass-bottomed dishes | (MatTek Corporation; Ashland, MA) | P35G-1.5-20-C | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). | F1141 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 31985-088 | |
| FRET microscopy system | Olympus inverted microscope (IX51) | ||
| CCD camera | Hamamatsu, Japan | ORCA285 | |
| SlideBook software 5.5 | Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO) | ||
| Ingenuity Pathway Analysis software | IPA, QIAGEN Redwood City, | ||
| Forskolin | Tocris (Ellisville, MO). | 1099 | Stock in100% EtOH |
| DMEM F-12 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 11330-057 | |
| HBSS | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 14025-134 | |
| Excel | Microsoft | ||
| PBS | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 10010-023 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Invitrogen(Carlsbad, CA) | R-001-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen(Carlsbad, CA) | 15140-122 |
References
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Arora, K., et al. Compartmentalization of cyclic nucleotide signaling: a question of when, where, and why?. Pflugers Arch. 465 (10), 1397-1407 (2013).
- Howe, A. K., Baldor, L. C., Hogan, B. P. Spatial regulation of the cAMP-dependent protein kinase during chemotactic cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (40), 14320-14325 (2005).
- Lim, C. J., et al. Integrin-mediated protein kinase A activation at the leading edge of migrating cells. Mol Biol Cell. 19 (11), 4930-4941 (2008).
- Paulucci-Holthauzen, A. A., et al. Spatial distribution of protein kinase A activity during cell migration is mediated by A-kinase anchoring protein AKAP Lbc. J Biol Chem. 284 (9), 5956-5967 (2009).
- Weaver, A. M., Young, M. E., Lee, W. L., Cooper, J. A. Integration of signals to the Arp2/3 complex. Curr Opin Cell Biol. 15 (1), 23-30 (2003).
- Le Clainche, C., Carlier, M. F. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. Physiol Rev. 88 (2), 489-513 (2008).
- Raftopoulou, M., Hall, A. Cell migration: Rho GTPases lead the way. Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).
- Krause, M., Dent, E. W., Bear, J. E., Loureiro, J. J., Gertler, F. B. Ena/VASP proteins: regulators of the actin cytoskeleton and cell migration. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 541-564 (2003).
- Hara, Y., et al. Inhibition of MRP4 prevents and reverses pulmonary hypertension in mice. J Clin Invest. 121 (7), (2011).
- Russel, F. G., Koenderink, J. B., Masereeuw, R. Multidrug resistance protein 4 (MRP4/ABCC4): a versatile efflux tra (7), 2888-289nsporter for drugs and signalling molecules. Trends Pharmacol Sci. 29 (4), 200-207 (2008).
- Cheepala, S., et al. Cyclic nucleotide compartmentalization: contributions of phosphodiesterases and ATP-binding cassette transporters. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 53, 231-253 (2013).
- Sinha, C., et al. Multi-drug resistance protein 4 (MRP4)-mediated regulation of fibroblast cell migration reflects a dichotomous role of intracellular cyclic nucleotides. J Biol Chem. 288 (6), 3786-3794 (2013).
- Popovici, C., et al. Direct and heterologous approaches to identify the LET-756/FGF interactome. BMC Genomics. 7 (105), (2006).
- Soler-Lopez, M., Zanzoni, A., Lluis, R., Stelzl, U., Aloy, P. Interactome mapping suggests new mechanistic details underlying Alzheimer’s disease. Genome Res. 21 (3), 364-376 (2011).
- Sinha, C., et al. PKA and actin play critical roles as downstream effectors in MRP4-mediated regulation of fibroblast migration. Cell Signal. 27 (7), 1345-1355 (2015).
- Liu, L., Wang, Y. D., Wu, J., Cui, J., Chen, T. Carnitine palmitoyltransferase 1A (CPT1A): a transcriptional target of PAX3-FKHR and mediates PAX3-FKHR-dependent motility in alveolar rhabdomyosarcoma cells. BMC Cancer. 12 (154), (2012).
- Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (26), 14997-15002 (2001).
- Sinha, C., et al. Forster resonance energy transfer – an approach to visualize the spatiotemporal regulation of macromolecular complex formation and compartmentalized cell signaling. Biochim Biophys Acta. 1840 (10), 3067-3072 (2014).
- Sato, M., Ozawa, T., Inukai, K., Asano, T., Umezawa, Y. Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells. Nat Biotechnol. 20 (3), 287-294 (2002).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochem Biophys Res Commun. 348 (2), 716-721 (2006).
- Ananthanarayanan, B., Ni, Q., Zhang, J. Signal propagation from membrane messengers to nuclear effectors revealed by reporters of phosphoinositide dynamics and Akt activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15081-15086 (2005).
- Yamaguchi, H., Condeelis, J. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion. Biochim Biophys Acta. 1773 (5), 642-652 (2007).
- Lamalice, L., Le Boeuf, F., Huot, J. Endothelial cell migration during angiogenesis. Circ Res. 100 (6), 782-794 (2007).
- Ghosh, M. C., Makena, P. S., Gorantla, V., Sinclair, S. E., Waters, C. M. CXCR4 regulates migration of lung alveolar epithelial cells through activation of Rac1 and matrix metalloproteinase-2. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (9), L846-L856 (2012).
- Vicente-Manzanares, M., Webb, D. J., Horwitz, A. R. Cell migration at a glance. J Cell Sci. 118 (Pt 21), 4917-4919 (2005).
- Zaccolo, M., et al. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. Nat Cell Biol. 2 (1), 25-29 (2000).
