Métodos de estudio de complejos macromoleculares que contienen MRP4-en el Reglamento de Migración de fibroblastos

La migración celular es un proceso de múltiples pasos complicado. Los estudios han demostrado que las células durante la migración se polarizó en los bordes de ataque y salida. Al adherirse a la matriz extracelular, el borde de ataque proporciona la tracción necesaria para el cuerpo de la célula se mueva hacia adelante. Por último, las liberaciones se arrastran los bordes traseros adjuntos y completa el ciclo de migración ^1,2.

polarización de las células para la migración celular eficiente está regulada por la segregación espacial de señalización intracelular. Segundos mensajeros celulares, tales como cAMP, median en la compartimentación de los eventos de señalización requeridos para la migración celular ^3,4 direccional afinado. Acumulaciones preferenciales de cAMP y la actividad de PKA quinasa dependiente de cAMP en el borde delantero desempeñan un papel clave en la migración celular direccional de ^5,6. Mediante la fosforilación de las pequeñas GTPasas como sustrato relacionada con Ras toxina botulínica C3 (Rac) y el control de la división celular de proteínas 42 homólogo o Cdc42, PKA activa la proteína actina relacionadas con 2/3 (Arp 2/3) en el borde delantero e induce la formación de lamelipodia ^7-9. PKA también fosforila un agente anti-nivelación, vasodilatador estimulada fosfoproteína (VASP), de ese modo regula los ciclos de oscilación de extensión y retracción de la membrana ^10,11.

En las células, los niveles de cAMP están regulados por tres procesos principales: i) la síntesis de la adenilato ciclasa, ii) la degradación por fosfodiesterasas, y iii) el transporte por transportadores de salida unidos a la membrana ^3. proteína de resistencia a múltiples fármacos 4 (MRP4), un miembro de la ATP vinculante cassette (ABC) de la familia de transportadores de membrana, funciona como un transportador de eflujo endógena de nucleótidos cíclicos. Por lo tanto, MRP4 puede regular los niveles intracelulares de cAMP y dependiente de cAMP celular de señalización ^11-13. Hemos demostrado previamente que en MRP4 ^{– / -,} los fibroblastos contienen niveles relativamente altos de nucleótidos cíclicos y migran más rápido compared a MRP4 fibroblastos ^{+ / + 14.} También informó de un efecto bifásico de nucleótidos cíclicos sobre la migración de fibroblastos. Sobre la base de estudios previos y nuestra conclusión de que MRP4 ^{– / –} fibroblastos contiene cAMP más polarizada durante el transcurso de la migración, la hipótesis de que esta regulación MRP4 mediada por la migración de fibroblastos es dependiente de cAMP. Con el fin de comprender el mecanismo aguas abajo, tomamos un enfoque directo aún multifacético.

Para identificar las proteínas asociadas y en interacción con MRP4, immunoprecipitated complejos macromoleculares que contienen MRP4-a partir de células HEK293 que expresan más de MRP4. El uso de la espectrometría de masa, se identificaron varias proteínas que interaccionan con MRP4 y analizamos su interconectividad usando Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA es una herramienta útil para analizar las interacciones proteína-proteína (tanto estructurales como funcionales) y explorar sus aportaciones en particular, fisiológicos y patológicoseventos basados ​​en la literatura y las evidencias experimentales ^15,16. IPA indicó que F-actina es un importante objetivo aguas abajo de MRP4 en el contexto de la migración de células, donde cAMP y cGMP son la clave moléculas ¹⁷ de señalización. Estos datos fueron confirmados además por microscopía de alta contenido. Microscopía de alta contenido puede capturar y analizar los comportamientos celulares tales como la migración celular de una manera más conveniente, precisa y de alto rendimiento ^18. Los datos de alto contenido de microscopía demostraron que el efecto de MRP4 sobre la migración de fibroblastos está completamente abolida en la interrupción del citoesqueleto de actina o la inhibición de PKA ^17.

Además, se utilizó una transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) a base de sensor de PKA para controlar la dinámica de PKA en la migración de las células en tiempo real. Sensores de quinasa basados ​​en FRET por lo general consisten en péptidos sustrato de fosforilación específicos flanqueadas por PPC y YFP fluoróforos ^19-21. pmAKAR3 es una mejora y membrane dirigido sensor PKA basados ​​en FRET que contiene dominio forkhead-asociado 1 (FHA1) y la secuencia de sustrato de PKA LRRATLVD ^5,22. La fosforilación de pmAKAR3 por el pKa aumenta subunidad catalítica FRET señal entre CFP y YFP ^19. La inserción de un dominio de modificación de lípidos en el sensor se dirige a la membrana plasmática para el control de la dinámica de PKA, específicamente en el compartimento de membrana ^23.

Usando pmAKAR3, hemos demostrado que el borde delantero de la migración MRP4 ^{– / –} fibroblastos mostraron actividad PKA más polarizada que MRP4 fibroblastos ^{+ / +,} que a su vez incrementó la formación de actina cortical en borde de ataque de la célula ^17. En conjunto, estos eventos resultó en una mejor polarización celular y la migración celular más rápido direccional en ausencia de MRP4. Nuestro enfoque específico y directo identificado abajo objetivos clave para MRP4 y proporciona una importante, pero comoaún sin explorar del mecanismo para la regulación MRP4 dependiente de la migración de fibroblastos.