Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması
Summary
A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.
Abstract
Bezelye yaprak biti Acyrthosiphon Pisum, bir sıralı genom ve bol fenotipik plastisite ile genomik ve gelişimsel çalışmalar için gelişmekte olan bir model haline gelmiştir. Diğer yaprak bitleri, A gibi. Pisum embriyoları ovaryol bir montaj hattı moda yumurta odaları içinde geliştirmek partenogenetik doğuran üreme yoluyla hızla yaymak. Daha önce biz yaprak biti embriyolarda mRNA ifadesinin tespiti sağlayan in situ hibridizasyon tam mount güçlü bir platform kurduk. Protein ifadesini analiz etmek için olsa da, tatmin edici sonuçlar üretmek değil aseksüel viviparous Yaprakbitlerinin ovaryolden immün için protokol kurdu. Burada doku geçirgenliğini artırarak ve kurulan yaklaşımları uygularken sorunlarla her ikisi de arka plan boyama, azaltmak için optimize edilmiş koşulları bildirmektedir. Optimizasyon içerir: esas f bulunmuştur proteinaz K (1 ug / ml, 10 dakika), (1) inkübasyonorta ve geç evre yaprak biti embriyolarda veya antikor penetrasyon; Bir digoxigenin (DIG) tarafından tedarik edilen bir bloke edici tepkin madde ile normal keçi serumu / büyükbaş hayvan serum albümin (2) yerine ayarlanmış tampon ve endojenez peroksidazı ağartılması için, metanol yerine hidrojen peroksit (H2O 2), (3) bir uygulama merkezli; bu anlamlı biti dokularda bir arka plan renklendirmesini azaltmıştır. Immün için optimize Bu kritik şartlar A. Pisum ve diğer Yaprakbitlerinin embriyolar gen ürünlerinin etkin algılama sağlayacaktır.
Introduction
Yaprak bitleri küçük (1-10 mm) yumuşak organları ile hemipteran böceklerdir. Onlar piercing, ağız parçaları ile floem öz suyunu emerek bitkiler üzerinde beslenirler. Ek olarak, floem özsuyu diyet eksiktir esansiyel amino asitleri sentezlemek için, bir zorunlu endosimbiyotik bakterinin, Buchnera aphidicola güveniyor. Yaprak bitleri bahar ve yaz uzun gün fotoperiyodların ve kışlama yumurta 1,2 sınırlı sayıda yatıyordu sırasında kısa gün fotoperiyodların tarafından tetiklenen cinsel yumurtlayarak çoğalan üreme sırasında partenogenetik viviparous üreme içeren karmaşık bir hayat öyküsü var. İlkbaharda bu yumurtalar sonbahara kadar partenogenetik üreme çok sayıda mermi takip, hepsi kadın yaprak bitleri (fundatrices) birinci nesil üretmek için yumurtadan. Yıllık yaşam döngüsünde eşeysiz ve cinsel fazlar alternatif, evrimsel yenilik 1,2 olarak kabul edilmiştir yaprak bitleri, devresel parthenogenesis. Partenogenetik viviparous yaprak bitleri içinde, Embryogenesis yumurtalık tübül (ovaryolden) yumurta odaları içinde yer alır. Buna karşılık, cinsel yumurtlayarak çoğalan embriyolar döllenmiş yumurtanın içinde gelişir. Ayrı üreme plastisite gelen, yaprak bitleri kuşaklararası kanat polyphenism görüntüleyebilirsiniz: kalabalık sinyalleri ve predatör tehditlerine yanıt olarak, unwinged aseksüel dişiler viviparously uzun mesafe göç kanatlı yavrular üretebilir. Bezelye yaprak biti genom dizisinin Yayın Acyrthosiphon Pisum -the ilk genom sekansı, bir bazal hemimetabolus böcek sağlar üreme plastisitesi, kanat polyphenism ve molekül üzerindeki yaprak biti böcek bitki etkileşimleri viral vektör ve ortak yaşam dahil olmak üzere diğer özelliklerin daha da araştırma temeli 3.
Sıralı genom ek olarak, gen ekspresyonu ve fonksiyonunu karakterize etmek için araçlar, olgun bir model organizma olarak 4 bezelye yaprak biti teşvik etmek için gereklidir. Biz bütün-mount sağlam protokoller tanımlamışlardır <em> biti embriyoların 5-7 mRNA ekspresyonunu tespit etmek için in situ hibridizasyon. Çift kollu bir RNA enjeksiyon ve besleme ile RNA interferans (RNAi) biti nimf ve yetişkinlerde gen susturma kullanılmaktadır, ancak embriyolar demonte gen için stabil şartlar yapılmamış 8-10 rapor edilmemiştir. Immün ve RNAi demonte sonra bezelye yaprak biti embriyolar 11-13 yapılmadan önce numuneler içindeki protein ifadesi tespit edebilir bir antikor-bazlı yaklaşım. Ancak, doku geçirgenliği ve arka plan boyama ortadan kaldırılması artış bezelye yaprak biti aseksüel viviparous embriyolar immün standart protokolleri kullanarak henüz tatmin edici değildir. Örneğin, dokulara antikorun bu penetrasyon Gastrulasyon embriyolarda azaldığı bulundu (8-10 evre) ve morfolojik olarak tanımlanabilir ekstremite tomurcukları (aşamaları 13-14) ile embriyolar antikor zorlukla geçirgen olduğunu. Buna ek olarak, arka plan renklenmesi eşeysiz viviparo görüntülenmiştir edildigerm işaretleyici Vasa yanı sıra buna karşı embriyonik segmentlerde 12,13 olarak ifade Engrailed / Invected proteinine karşı antikor kullanılarak boyandı bize bezelye yaprak biti embriyolar. Aslında arka plan renklenmesi yine tek başına ikincil antikor ile boyandı embriyolar açıkça görülebilir.
Yaprak biti dokuların bütünlüğünü bozmadan geçirgenliğini arttırmak için dikkatli bir şekilde proteinaz K konsantrasyonunun titre edildi ve yaprak biti embriyolar Doku sindirimi için en uygun koşulları belirlendi. Bezelye yaprak biti spesifik olmayan lekelenmenin engellenmesi için, etkili bir şekilde bloke eder ve embriyolar endojen peroksidaz (POD) aktivitesini, immün sırasında sinyallerini yükseltmek için kullanılan bir enzim baskılayabilir bileşikleri aramışlardır. Geleneksel olarak kullanılan normal keçi serumu yerine (NGS) bir digoxigenin (DIG) bazlı tampon seti tarafından temin edilen bir bloke edici tepkin maddesi / sığır serum albümini (BSA), önemli ölçüde bir arka plan renklendirmesini azalttı. Ayrıca, metanol inhi bulunmuşturHidrojen peroksit daha etkili endojen POD faaliyetini bit (H 2 O 2). Embriyoların üzerinde immün için bu yaprak biti özgü koşullarına ilişkin ayrıntılar aşağıdaki bölümlerde açıklanacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz bezelye yaprak biti A başarılı immün kritik uygun koşulları belirledi. Pisum, genomik ve gelişim çalışmalarında 3,15 için gelişmekte olan bir model organizmadır. Doku geçirgenliğini artırarak ve arka plan boyama azaltmak için optimize edilmiş koşullar yoğunluğu ve sinyallerin özgüllüğünü geliştirilmiş. Bunlar, hücre zarlarında gözenekleri oluşturma ve spesifik olmayan bağlanma bloke edici antikor için aşamalar diğer hayvan modellerinde immün için s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Chau-Ti Ting (Fly Core in Taiwan) for providing the monoclonal 4D9 antibody, Technology Commons (TechComm) of the College of Life Science NTU for confocal microscopy, Hsiao-Ling Lu for proofreading the manuscript, and Chen-yo Chung for helping filming. CC particularly thanks Charles E. Cook for providing strategic suggestions and for critical editing of the manuscript. This work was supported by the Ministry of Science and Technology (101-2313-B-002-059-MY3 and 104-2313-B-002-022-MY3 for GWL and CC), and the National Taiwan University (NTU-CESRP 101R4602D3 for CC; 103R4000 for GWL).
Materials
| 30% hydrogen perxidase (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 18304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| 4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody | Developmental studies hybridoma bank | AB_528224 | For labeling the developing segments of embryo. |
| ApVas1 rabbit polyclonal antibody | Our laboratory | N/A | For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory. |
| Austerlitz Insect pins | ENTOMORAVIA | N/A | For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Camera connted to compound microscope | Canon | EOS 5D | For photographing of aphid embryos. |
| Colorimetric 8 cell tray | Kartell Labware | 357 | For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm. |
| Compound microscope with DIC optics | Leica Microsystems | DMR | For photographing of aphid embryo mounted on the slides. |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Sigma-Aldrich (Roche) | 1.1586E+10 | For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent. |
| Forceps | Ideal-tek | N/A | For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA. |
| Glass dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
| Glycine | Bioshop | N/A | For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK). |
| Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | For detection of primary antibody from mouse. |
| Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A21072 | For detection of primary antibody from rabbit. |
| Intelli mixer | ELMI laboratory equipment | RM-2M | For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries. |
| Laser-scanning confocal microscopy | Leica Microsystems | SP5 | For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag. |
| methanol | Burdick and Jackson | AH2304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| Microscope slides | Thermo scientific | 10143560 | For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm. |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101030 | For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101050 | For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A) | Santa Cruz Biotechnology | sc-32293 | For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells. |
| Nail polish | N/A | N/A | For sealing the coverslips on the slides. |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Paraformaldehyde (PFA) | VWR | MK262159 | For fixation of aphid ovaries. |
| Phalloidin-TRITC | Sigma-Aldrich | P1951 | For labeling the distrbution of F-actin on embryos. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | As isotonic solution for aphid ovaries. |
| Plastic dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml. |
| Proteinase K | Merck | 124678 | For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies. |
| Pyrex spot plate | N/A | N/A | For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and depth 7 mm. |
| SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets | Sigma-Aldrich | D4168 | For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set. |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | EZ4 | For dissection and observation of aphid ovaries. |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | For creating pores (punching) on the cell membrane. |
| VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector laboratories | PK-6101 | For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents. |
| VECTASHIELD mounting medium | Vector laboratories | H1000 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
References
- Blackman, R. L., Minks, A. K., Harrewijn, P. Reproduction, cytogenetics and development. Aphids: their biology, natural enemies. , 163-195 (1987).
- Davis, G. K. Cyclical parthenogenesis and viviparity in aphids as evolutionary novelties. J. Exp. Zool. 318, 448-459 (2012).
- The International Aphid Genomics Consortium. Genome sequence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biol. 8 (2), e1000313 (2010).
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends Genet. 24 (7), 353-360 (2008).
- Chang, C., et al. Apvasa marks germ-cell migration in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea)). Dev. Genes Evol. 217 (4), 275-287 (2007).
- Chang, C., et al. Whole-mount identification of gene transcripts in aphids: Protocols and evaluation of probe accessibility. Arch. Insect Biochem. 68 (4), 186-196 (2008).
- Chung, C. Y., Cook, C. E., Lin, G. W., Huang, T. Y., Chang, C. Reliable protocols for whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) in the pea aphid Acyrthosiphon pisum: a comprehensive survey and analysis. Insect Sci. 21 (3), 265-277 (2014).
- Mutti, N. S., Park, Y., Reese, J. C., Reeck, G. R. RNAi knockdown of a salivary transcript leading to lethality in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J. Insect Sci. 6, 38 (2006).
- Jaubert-Possamai, S., et al. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC Biotechnol. 7, 63 (2007).
- Sapountzis, P., et al. New insight into the RNA interference response against cathepsin-L gene in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum: Molting or gut phenotypes specifically induced by injection or feeding treatments. Insect Biochem. Mol. Biol. 51, 20-32 (2014).
- Braendle, C., et al. Developmental origin and evolution of bacteriocytes in the aphid-Buchnera symbiosis. PLoS Biol. 1 (1), e21 (2003).
- Miura, T., et al. A comparison of parthenogenetic and sexual embryogenesis of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea). J. Exp. Zool. 295 (1), 59-81 (2003).
- Chang, C., Lee, W. C., Cook, C. E., Lin, G. W., Chang, T. Germ-plasm specification and germline development in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum: Vasa and Nanos as markers. Int. J. Dev. Biol. 50 (4), 413-421 (2006).
- Koshy, A. A., Cabral, C. M. 3-D imaging and analysis of neurons infected in vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237 (2014).
- Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. Bioessays. 28 (7), 747-755 (2006).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Harland, R. M. In-situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Method. Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Wolff, C., Sommer, R., Schroder, R., Glaser, G., Tautz, D. Conserved and divergent expression aspects of the Drosophila segmentation gene hunchback in the short germ band embryo of the flour beetle Tribolium. Development. 121 (12), 4227-4236 (1995).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23 (4), 345-358 (2001).
- Lin, G. W., Cook, C. E., Miura, T., Chang, C. Posterior localization of ApVas1 positions the preformed germ plasm in the sexual oviparous pea aphid Acyrthosiphon pisum. Evodevo. 5, 18 (2014).
- Straus, W. Inhibition of peroxidase by methanol and by methanol-nitroferricyanide for use in immunoperoxidase procedures. J. Histochem. Cytochem. 19 (11), 682-688 (1971).
