Идентификация критических условий для Иммуноокрашивание в гороховой тли эмбрионов: Повышение проницаемости тканей и уменьшения фонового окрашивания
Summary
A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.
Abstract
Гороха тля гороховая тля, с геномом, последовательность и обильным фенотипической пластичности, стала моделью для новых геномных исследований и развития. Как и другие тли, А. Pisum быстро распространяться с помощью партеногенетической живородящих воспроизводства, где эмбрионы развиваются в течение яичных камер в сборочной линии в яйцевая трубка. Ранее мы создали надежную платформу всей горе-гибридизация, позволяющий обнаруживать экспрессии мРНК в эмбрионы тлей. Для анализа экспрессии белка, хотя, разработали протоколы иммуноокрашивания в овариол бесполого живородящих тлей не дает удовлетворительных результатов. Здесь мы сообщаем условия, оптимизированные для увеличения проницаемости тканей и уменьшения фонового окрашивания, оба из которых были проблемы при применении установленных подходов. Оптимизация включает: (1) инкубацию протеиназы К (1 мкг / мл, 10 мин), который был найден существенный Fили проникновение антител в середине и в конце этапа тли эмбрионов; (2) замена нормальной козьей сыворотке / бычьего сывороточного альбумина с блокирующим реагентом, подаваемой дигоксигенином (DIG) основе буфера установить и (3) применение метанола, а перекись водорода (H 2 O 2) для отбеливания эндогенной пероксидазы; что значительно уменьшило окрашивание фона в тлей тканей. Эти критические условия, оптимизированные для иммуноокрашивания позволит осуществлять эффективное выявление генных продуктов в эмбрионах а. PISUM и других тлей.
Introduction
Тли hemipteran насекомые с небольшой (1-10 мм) мягких тел. Они питаются растениями, высасывая сок флоэмы с пронзительными ротового аппарата. Кроме того, они полагаются на облигатной эндосимбиотических бактерии, Buchnera aphidicola, синтезировать незаменимые аминокислоты, которые испытывают дефицит флоэмы сока диеты. Тли имеют сложную историю жизни, что включает в себя партеногенетическое живородящих воспроизведение весной и летом длинного дня фотопериодов и сексуальной яйцекладущие воспроизводства, вызванного короткого дня фотопериодов в течение которого они лежали ограниченное количество зимующих яиц 1,2. Весной эти яйца люк, чтобы произвести первое поколение все женщины тлей (fundatrices), следующая много раундов партеногенетической воспроизводства до осени. Циклический партеногенез в тлей, где бесполое и половое фазы чередуются в годичном цикле жизни, была расценена как эволюционный новизны 1,2. В партеногенетических живородящие тлей, Эмбриогенез происходит внутри яйца палат яичников канальцев (овариол). Напротив, сексуальные яйценосные эмбрионы развиваются в удобренных яиц. Помимо репродуктивного пластичности, тли может отображать трансгенерационной крыло polyphenism: в ответ на перенаселенность сигналов и хищников угроз, то unwinged бесполые самки могут производить viviparously крылатого потомства для дальней миграции. Публикация генома в гороховой тли гороховая тля -Первый последовательность генома для базальной hemimetabolous насекомых позволяет дальнейшее изучение репродуктивного пластичности, крыла polyphenism и других функций, включая насекомых растений взаимодействий, вирусной векторизации и симбиоза в тлей на молекулярном Основой 3.
В дополнение к геномом, последовательность, методов структурного гена и экспрессию функцию необходимы для содействия гороховой тли как зрелый модельного организма 4. Мы описали надежные протоколы всей горе- <em> в гибридизация для определения экспрессии мРНК в тлей эмбрионов 5-7. РНК-интерференция (RNAi) с помощью двухцепочечной РНК инъекции и кормления был использован для генной глушителей в тлей нимф и взрослых, но стабильные условия для гена нокдаун в эмбрионов пока не сообщается 8-10. Иммуноокрашивание, подход на основе антител, которые можно обнаружить экспрессию белка в образцах до и после RNAi нокдауна, была выполнена на гороховой тли эмбрионов 11-13. Тем не менее, увеличение проницаемости тканей и ликвидации фоне окрашивания пока еще неудовлетворительно, используя стандартные протоколы для иммуноокрашивания в бесполых живородящих эмбрионов гороховой тли. Например, мы обнаружили, что проникновение антител к тканям снизилась в gastrulating эмбрионов (стадии 8-10) и, что эмбрионы с морфологически идентифицируемые почки конечностей (стадии 13-14) были едва проницаемой для антител. Кроме того, фон окрашивание визуализировали в бесполого viviparoкомпании эмбрионы гороховой тли окрашенные с помощью антитела против зародышевой линии маркера Васа, а также, что против белка Engrailed / внесенный выраженной в эмбриональных сегментов 12,13. На самом деле фон окрашивание еще ясно видны в эмбрионах, окрашенных только вторичным антителом.
Для того чтобы увеличить проницаемость без повреждения целостности тканей тли, мы тщательно титруют концентрации протеиназы К, и определяют оптимальные условия для переваривания тканей эмбрионов на тлей. Для того чтобы избежать неспецифического окрашивания в гороховой тли, мы искали соединений, которые могли бы эффективно блокируют эмбрионов и подавления активности эндогенной пероксидазы (POD), фермент, используемый для усиления сигналов во иммунное окрашивание. Блокирующий реагент обеспечивается дигоксигенином (DIG) основе набора буфера, а традиционно используемой нормальной козьей сыворотки (NGS) / бычий сывороточный альбумин (БСА), значительно уменьшается фоновое окрашивание. Кроме того, метанол было обнаружено inhiбит эндогенного POD деятельность более эффективно, чем перекись водорода (H 2 O 2). Подробнее об этих тлей конкретных условий иммуноокрашивания на зародышах будут описаны в следующих разделах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы определили оптимальные условия решающее значение для успешного иммуноокрашивания в гороховой тли А. Pisum, появляющаяся модельный организм для геномных исследований и развития 3,15. Оптимизированные условия для увеличения проницаемости тканей и уменьшения окрашивани?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Chau-Ti Ting (Fly Core in Taiwan) for providing the monoclonal 4D9 antibody, Technology Commons (TechComm) of the College of Life Science NTU for confocal microscopy, Hsiao-Ling Lu for proofreading the manuscript, and Chen-yo Chung for helping filming. CC particularly thanks Charles E. Cook for providing strategic suggestions and for critical editing of the manuscript. This work was supported by the Ministry of Science and Technology (101-2313-B-002-059-MY3 and 104-2313-B-002-022-MY3 for GWL and CC), and the National Taiwan University (NTU-CESRP 101R4602D3 for CC; 103R4000 for GWL).
Materials
| 30% hydrogen perxidase (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 18304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| 4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody | Developmental studies hybridoma bank | AB_528224 | For labeling the developing segments of embryo. |
| ApVas1 rabbit polyclonal antibody | Our laboratory | N/A | For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory. |
| Austerlitz Insect pins | ENTOMORAVIA | N/A | For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Camera connted to compound microscope | Canon | EOS 5D | For photographing of aphid embryos. |
| Colorimetric 8 cell tray | Kartell Labware | 357 | For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm. |
| Compound microscope with DIC optics | Leica Microsystems | DMR | For photographing of aphid embryo mounted on the slides. |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Sigma-Aldrich (Roche) | 1.1586E+10 | For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent. |
| Forceps | Ideal-tek | N/A | For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA. |
| Glass dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
| Glycine | Bioshop | N/A | For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK). |
| Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | For detection of primary antibody from mouse. |
| Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A21072 | For detection of primary antibody from rabbit. |
| Intelli mixer | ELMI laboratory equipment | RM-2M | For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries. |
| Laser-scanning confocal microscopy | Leica Microsystems | SP5 | For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag. |
| methanol | Burdick and Jackson | AH2304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| Microscope slides | Thermo scientific | 10143560 | For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm. |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101030 | For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101050 | For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A) | Santa Cruz Biotechnology | sc-32293 | For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells. |
| Nail polish | N/A | N/A | For sealing the coverslips on the slides. |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Paraformaldehyde (PFA) | VWR | MK262159 | For fixation of aphid ovaries. |
| Phalloidin-TRITC | Sigma-Aldrich | P1951 | For labeling the distrbution of F-actin on embryos. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | As isotonic solution for aphid ovaries. |
| Plastic dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml. |
| Proteinase K | Merck | 124678 | For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies. |
| Pyrex spot plate | N/A | N/A | For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and depth 7 mm. |
| SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets | Sigma-Aldrich | D4168 | For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set. |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | EZ4 | For dissection and observation of aphid ovaries. |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | For creating pores (punching) on the cell membrane. |
| VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector laboratories | PK-6101 | For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents. |
| VECTASHIELD mounting medium | Vector laboratories | H1000 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
References
- Blackman, R. L., Minks, A. K., Harrewijn, P. Reproduction, cytogenetics and development. Aphids: their biology, natural enemies. , 163-195 (1987).
- Davis, G. K. Cyclical parthenogenesis and viviparity in aphids as evolutionary novelties. J. Exp. Zool. 318, 448-459 (2012).
- The International Aphid Genomics Consortium. Genome sequence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biol. 8 (2), e1000313 (2010).
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends Genet. 24 (7), 353-360 (2008).
- Chang, C., et al. Apvasa marks germ-cell migration in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea)). Dev. Genes Evol. 217 (4), 275-287 (2007).
- Chang, C., et al. Whole-mount identification of gene transcripts in aphids: Protocols and evaluation of probe accessibility. Arch. Insect Biochem. 68 (4), 186-196 (2008).
- Chung, C. Y., Cook, C. E., Lin, G. W., Huang, T. Y., Chang, C. Reliable protocols for whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) in the pea aphid Acyrthosiphon pisum: a comprehensive survey and analysis. Insect Sci. 21 (3), 265-277 (2014).
- Mutti, N. S., Park, Y., Reese, J. C., Reeck, G. R. RNAi knockdown of a salivary transcript leading to lethality in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J. Insect Sci. 6, 38 (2006).
- Jaubert-Possamai, S., et al. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC Biotechnol. 7, 63 (2007).
- Sapountzis, P., et al. New insight into the RNA interference response against cathepsin-L gene in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum: Molting or gut phenotypes specifically induced by injection or feeding treatments. Insect Biochem. Mol. Biol. 51, 20-32 (2014).
- Braendle, C., et al. Developmental origin and evolution of bacteriocytes in the aphid-Buchnera symbiosis. PLoS Biol. 1 (1), e21 (2003).
- Miura, T., et al. A comparison of parthenogenetic and sexual embryogenesis of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea). J. Exp. Zool. 295 (1), 59-81 (2003).
- Chang, C., Lee, W. C., Cook, C. E., Lin, G. W., Chang, T. Germ-plasm specification and germline development in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum: Vasa and Nanos as markers. Int. J. Dev. Biol. 50 (4), 413-421 (2006).
- Koshy, A. A., Cabral, C. M. 3-D imaging and analysis of neurons infected in vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237 (2014).
- Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. Bioessays. 28 (7), 747-755 (2006).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Harland, R. M. In-situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Method. Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Wolff, C., Sommer, R., Schroder, R., Glaser, G., Tautz, D. Conserved and divergent expression aspects of the Drosophila segmentation gene hunchback in the short germ band embryo of the flour beetle Tribolium. Development. 121 (12), 4227-4236 (1995).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23 (4), 345-358 (2001).
- Lin, G. W., Cook, C. E., Miura, T., Chang, C. Posterior localization of ApVas1 positions the preformed germ plasm in the sexual oviparous pea aphid Acyrthosiphon pisum. Evodevo. 5, 18 (2014).
- Straus, W. Inhibition of peroxidase by methanol and by methanol-nitroferricyanide for use in immunoperoxidase procedures. J. Histochem. Cytochem. 19 (11), 682-688 (1971).
