Identificação de condições críticas para Immunostaining no Pea Aphid Embriões: Aumento Tissue permeabilidade e diminuir a coloração de fundo

Pulgões são insetos hemípteros com pequenos (1-10 mm) corpos macios. Eles se alimentam de plantas sugando a seiva floema com mouthparts piercing. Além disso, eles contam com uma bactéria endosymbiotic obrigatório, Buchnera aphidicola, para sintetizar aminoácidos essenciais que são deficientes na dieta seiva floema. Pulgões tem uma história de vida complexo que inclui reprodução vivípara parthenogenetic durante a primavera eo verão fotoperíodo longo dia e reprodução ovípara sexual desencadeada por fotoperíodos de curto-dia durante o qual eles estabelecem um número limitado de ovos overwintering ^1,2. Na Primavera esses ovos eclodem para produzir a primeira geração de todo-fêmea pulgões (fundatrices), na sequência de muitas rodadas de reprodução parthenogenetic até o outono. A partenogênese cíclico em pulgões, onde fases sexuada e assexuada, alternam no ciclo de vida anual, tem sido considerada como um ^1,2 novidade evolucionária. Nos pulgões vivíparos partenogenéticas, Embriogênese ocorre dentro de câmaras de ovos dos túbulos ovarianos (ovaríolos). Em contrapartida, os embriões ovíparos sexuais desenvolver nos ovos fertilizados. Além de plasticidade reprodutiva, os pulgões podem exibir transgeracional polifenismo asa: em resposta a sinais de superlotação e ameaças de predadores, as fêmeas assexuadas unwinged pode vivíparos produzir descendentes voado para a migração de longa distância. Publicação da sequência do genoma do pulgão da ervilha pisum Acyrthosiphon -a primeira sequência de genoma para uma basal inseto-hemimetabolous permite uma maior exploração da plasticidade reprodutiva, asa polifenismo, e outros recursos, incluindo interações inseto-planta, vetorização viral e simbiose em pulgões em um molecular ³ base.

Além do genoma sequenciado, ferramentas para caracterizar expressão e função do gene são necessários para promover o afídeo da ervilha como um organismo modelo ⁴ madura. Nós descrevemos protocolos robustos de todo-mount <em> hibridação in situ para detectar a expressão de ARNm em embriões de afídeos ^5-7. Interferência de RNA (RNAi), através de injecção de ARN de cadeia dupla e de alimentação foi usado para silenciamento de genes em ninfas de afídeos e adultos, mas condições estáveis ​​para o gene knockdown nos embriões não foram ainda relatados ^8-10. A imunocoloração, uma abordagem baseada em anticorpo que se pode detectar a expressão de proteínas em amostras antes e depois de ARNi knockdown, foi realizada em embriões de ervilha ^11-13 afídeos. No entanto, o aumento da permeabilidade do tecido e a eliminação de coloração de fundo é ainda insatisfatória utilizando protocolos convencionais para a imunocoloração nas embriões vivíparos assexuadas de ervilha pulgão. Por exemplo, verificou-se que a penetração do anticorpo aos tecidos diminuiu em embriões gastrulating (fases 8-10) e que os embriões com brotos dos membros morfologicamente identificáveis ​​(etapas 13-14) eram pouco permeável ao anticorpo. Além disso, a coloração de fundo foi visualizado no viviparo assexuadaUS embriões de afídeos de ervilha coradas utilizando o anticorpo contra o marcador da linha germinativa dos vasos, bem como contra a proteína que Engrailed / Invected expressa nos segmentos embrionárias ^12,13. Na verdade, a coloração de fundo foi ainda claramente visível em embriões corados com o anticorpo secundário sozinho.

A fim de aumentar a permeabilidade, sem danificar a integridade dos tecidos de afídeos, cuidadosamente titulada a concentração de proteinase K e determinaram as condições óptimas para a digestão de tecidos de embriões de afídeos. A fim de evitar coloração não específica na ervilha pulgão, temos procurado por compostos que poderia bloquear eficazmente os embriões e suprimir a actividade endógena de peroxidase (POD), uma enzima utilizada para amplificar os sinais durante a imunocoloração. Um reagente de bloqueio proporcionada por uma digoxigenina (DIG) -based conjunto tampão, em vez do soro de cabra normal utilizado tradicionalmente (NGS) / albumina do soro bovino (BSA), reduziu significativamente a coloração de fundo. Além disso, o metanol foi encontrado para inhimordeu a actividade POD endógena mais eficaz do que o peróxido de hidrogénio (H _{2 O 2).} Os detalhes a respeito dessas condições específicas de afídeos para immunostaining sobre os embriões serão descritos nas seções a seguir.