זיהוי של תנאים קריטיים לImmunostaining באפונה בכנימות עוברים: הגדלת רקמות חדירות והפחתת מכתים רקע
Summary
A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.
Abstract
Pisum Acyrthosiphon כנימת האפון, עם הגנום רצף וגמישות פנוטיפית שפע, הפך מודל מתעורר ללימודים הגנומי והתפתחותיים. כמו כנימות אחרות,. Pisum להפיץ במהירות באמצעות רבייה משריצה פרתנוגנטית, שבו עובר לפתח בתוך תאי ביצה באופנת פס ייצור בovariole. בעבר הקמנו פלטפורמה חזקה של כל הר הכלאה באתר המאפשרת זיהוי של ביטוי mRNA בעוברי הכנימה. לניתוח הביטוי של חלבון, אם כי, הוקם פרוטוקולים לimmunostaining ovarioles של כנימות משריצות מיניות לא הניב תוצאות משביעות רצון. כאן אנו מדווחים תנאים מותאמים להגדלת חדירות רקמות ולהפחית מכתים רקע, אשר שניהם היו בעיות בעת החלת גישות הוקמו. אופטימיזציות כוללות: (1) דגירה של K (1 מיקרוגרם / מיליליטר, 10 דקות) proteinase, שנמצא F החיוניאו חדירת נוגדן בעוברי אמצע וכנימה בשלב מאוחר; (2) החלפה של אלבומין בסרום סרום עז / שור הרגיל עם מגיב חסימה מסופק על ידי digoxigenin (DIG) מבוסס חיץ להגדיר ו( 3) יישום של מתנול ולא מי חמצן (H 2 O 2) להלבנת peroxidase אנדוגני; אשר הקטין באופן משמעותי את מכתים הרקע ברקמות הכנימה. תנאים אלה קריטיים מותאמים לimmunostaining יאפשר איתור יעיל של מוצרי גן בעוברים של. pisum וכנימות אחרות.
Introduction
כנימות הן חרקים hemipteran עם גופים רכים (1-10 מ"מ) קטנים. הם ניזונים צמחים על ידי מציצת לשד השיפה עם איברי פה פירסינג. בנוסף, הם מסתמכים על חיידק endosymbiotic לחייב, aphidicola Buchnera, לסנתז חומצות אמינו חיוניות שחסרות בתזונת SAP השיפה. יש כנימות היסטורית חיים מורכבות הכוללת רבייה משריצה פרתנוגנטית במהלך האביב וphotoperiods ארוך ביום הקיץ ורבייה מינית מֵטִיל בֵּיצִים מופעלת על ידי photoperiods קצר-היום שבמהלכו הם שכבו במספר מוגבל של ביצי overwintering 1,2. באביב ביצים אלה בוקעים לייצר הדור הראשון של כל הנקבה הכנימות (fundatrices), הבאות סיבובים רבים של רבייה פרתנוגנטית עד סתיו. רביית הבתולים המחזוריות בכנימות, שם חלופי שלבים מיניים ומיניים במחזור החיים השנתי, כבר נחשבו 1,2 חידוש אבולוציוני. בכנימות המשריצות פרתנוגנטית, עובר מתרחש בתוך תאי ביצה של צינוריות השחלות (ovarioles). לעומת זאת, עובר מֵטִיל בֵּיצִים מיני לפתח בביציות המופרות. מלבד פלסטיות רבייה, כנימות יכולות להציג polyphenism אגף הבין דור: בתגובה לאותות צפיפות ואיומי טורף, הנקבות מיניות unwinged יכולות viviparously לייצר צאצאים מכונפים להגירה למרחקים ארוכים. פרסום רצף הגנום של כנימת אפון Acyrthosiphon pisum חור' רצף הגנום הראשון לבסיס חרקים מאפשר hemimetabolous חקירה נוספת של פלסטיות רבייה, polyphenism אגף, ותכונות אחרות כוללים אינטראקציות חרקים צמח, vectoring הנגיפי וסימביוזה בכנימות על מולקולרי בסיס 3.
בנוסף להגנום רצף, כלים לאפיון ביטוי גנים ותפקוד נדרשים לקידום כנימת האפונה כאורגניזם מודל בוגר 4. שתארנו פרוטוקולים חזקים של כל הר <em> הכלאה באתר לאיתור ביטוי של mRNA בעוברי כנימה 5-7. התערבות RNA (RNAi) באמצעות הזרקת RNA פעמיים תקועים והאכלה שמשה במשך השתקת גנים בנימפות כנימה ומבוגרים, אבל תנאים יציבים לגן מציאה בעוברים לא דווחו 8-10 עדיין. Immunostaining, גישה מבוססת נוגדנים שיכולים לזהות ביטוי חלבון בדגימות לפני ואחרי מציאה RNAi, שבוצע בעוברי כנימת האפונה 11-13. עם זאת, גידול בשיעור של חדירות וחיסול מכתים רקע רקמה הוא עדיין לא מספק תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים לimmunostaining בעוברים המשריצים מיניים של כנימת האפון. לדוגמא, מצאנו כי החדירה של נוגדן לרקמות ירידה בעוברי gastrulating (שלבי 8-10) ושעובר עם ניצני איבר מורפולוגית לזיהוי (שלבי 13-14) היו בקושי חדיר לנוגדן. בנוסף, מכתים רקע היה דמיין בviviparo מינישלנו עובר כנימת אפונה מוכתמת באמצעות נוגדנים נגד סמן germline Vasa כמו גם שנגד חלבון Engrailed / Invected הביע במגזרים העובריים 12,13. למעשה מכתים רקע עדיין היה נראה בבירור בעוברים מוכתמים עם הנוגדנים משני בלבד.
על מנת להגדיל את החדירות מבלי לפגוע שלמות רקמות כנימה, אנחנו טיטרציה זהירות ריכוז proteinase K ונקבעו תנאים אופטימליים לעיכול רקמה על עוברי כנימה. על מנת להימנע מהכתמה אינה ספציפית בכנימת האפון, חיפשנו תרכובות שיכולים לחסום ביעילות עוברים ולדכא פעילות של peroxidase אנדוגני (POD), אנזים מועסק להגברת אותות במהלך immunostaining. מגיב חסימה הניתן על ידי קבוצת חיץ מבוססת digoxigenin (DIG), ולא עז בסרום הנורמלי משמש באופן מסורתי (NGS) / אלבומין בסרום שור (BSA), צמצם באופן משמעותי מכתים רקע. יתר על כן, מתנול נמצא inhiנשך את פעילות POD אנדוגני בצורה יעילה יותר מאשר מי חמצן (H 2 O 2). פרטים בדבר תנאי כנימה ספציפית אלה לimmunostaining על עוברים יהיו מתוארים בסעיפים הבאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהינו תנאים אופטימליים קריטיים לimmunostaining המוצלח בכנימת האפונה. Pisum, אורגניזם מודל מתעורר ללימודים הגנומי והתפתחותיים 3,15. תנאים אופטימליים להגדלת חדירות רקמות והפחתת מכתים רקע משופר העצמה וספציפיות של אותות. הם שונים מפרוטוקולים סטנדרטיים לimmunostaining במודל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Chau-Ti Ting (Fly Core in Taiwan) for providing the monoclonal 4D9 antibody, Technology Commons (TechComm) of the College of Life Science NTU for confocal microscopy, Hsiao-Ling Lu for proofreading the manuscript, and Chen-yo Chung for helping filming. CC particularly thanks Charles E. Cook for providing strategic suggestions and for critical editing of the manuscript. This work was supported by the Ministry of Science and Technology (101-2313-B-002-059-MY3 and 104-2313-B-002-022-MY3 for GWL and CC), and the National Taiwan University (NTU-CESRP 101R4602D3 for CC; 103R4000 for GWL).
Materials
| 30% hydrogen perxidase (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 18304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| 4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody | Developmental studies hybridoma bank | AB_528224 | For labeling the developing segments of embryo. |
| ApVas1 rabbit polyclonal antibody | Our laboratory | N/A | For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory. |
| Austerlitz Insect pins | ENTOMORAVIA | N/A | For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Camera connted to compound microscope | Canon | EOS 5D | For photographing of aphid embryos. |
| Colorimetric 8 cell tray | Kartell Labware | 357 | For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm. |
| Compound microscope with DIC optics | Leica Microsystems | DMR | For photographing of aphid embryo mounted on the slides. |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Sigma-Aldrich (Roche) | 1.1586E+10 | For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent. |
| Forceps | Ideal-tek | N/A | For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA. |
| Glass dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
| Glycine | Bioshop | N/A | For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK). |
| Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | For detection of primary antibody from mouse. |
| Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A21072 | For detection of primary antibody from rabbit. |
| Intelli mixer | ELMI laboratory equipment | RM-2M | For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries. |
| Laser-scanning confocal microscopy | Leica Microsystems | SP5 | For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag. |
| methanol | Burdick and Jackson | AH2304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| Microscope slides | Thermo scientific | 10143560 | For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm. |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101030 | For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101050 | For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A) | Santa Cruz Biotechnology | sc-32293 | For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells. |
| Nail polish | N/A | N/A | For sealing the coverslips on the slides. |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Paraformaldehyde (PFA) | VWR | MK262159 | For fixation of aphid ovaries. |
| Phalloidin-TRITC | Sigma-Aldrich | P1951 | For labeling the distrbution of F-actin on embryos. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | As isotonic solution for aphid ovaries. |
| Plastic dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml. |
| Proteinase K | Merck | 124678 | For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies. |
| Pyrex spot plate | N/A | N/A | For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and depth 7 mm. |
| SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets | Sigma-Aldrich | D4168 | For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set. |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | EZ4 | For dissection and observation of aphid ovaries. |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | For creating pores (punching) on the cell membrane. |
| VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector laboratories | PK-6101 | For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents. |
| VECTASHIELD mounting medium | Vector laboratories | H1000 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
References
- Blackman, R. L., Minks, A. K., Harrewijn, P. Reproduction, cytogenetics and development. Aphids: their biology, natural enemies. , 163-195 (1987).
- Davis, G. K. Cyclical parthenogenesis and viviparity in aphids as evolutionary novelties. J. Exp. Zool. 318, 448-459 (2012).
- The International Aphid Genomics Consortium. Genome sequence of the pea aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biol. 8 (2), e1000313 (2010).
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends Genet. 24 (7), 353-360 (2008).
- Chang, C., et al. Apvasa marks germ-cell migration in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea)). Dev. Genes Evol. 217 (4), 275-287 (2007).
- Chang, C., et al. Whole-mount identification of gene transcripts in aphids: Protocols and evaluation of probe accessibility. Arch. Insect Biochem. 68 (4), 186-196 (2008).
- Chung, C. Y., Cook, C. E., Lin, G. W., Huang, T. Y., Chang, C. Reliable protocols for whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) in the pea aphid Acyrthosiphon pisum: a comprehensive survey and analysis. Insect Sci. 21 (3), 265-277 (2014).
- Mutti, N. S., Park, Y., Reese, J. C., Reeck, G. R. RNAi knockdown of a salivary transcript leading to lethality in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum. J. Insect Sci. 6, 38 (2006).
- Jaubert-Possamai, S., et al. Gene knockdown by RNAi in the pea aphid Acyrthosiphon pisum. BMC Biotechnol. 7, 63 (2007).
- Sapountzis, P., et al. New insight into the RNA interference response against cathepsin-L gene in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum: Molting or gut phenotypes specifically induced by injection or feeding treatments. Insect Biochem. Mol. Biol. 51, 20-32 (2014).
- Braendle, C., et al. Developmental origin and evolution of bacteriocytes in the aphid-Buchnera symbiosis. PLoS Biol. 1 (1), e21 (2003).
- Miura, T., et al. A comparison of parthenogenetic and sexual embryogenesis of the pea aphid Acyrthosiphon pisum (Hemiptera: Aphidoidea). J. Exp. Zool. 295 (1), 59-81 (2003).
- Chang, C., Lee, W. C., Cook, C. E., Lin, G. W., Chang, T. Germ-plasm specification and germline development in the parthenogenetic pea aphid Acyrthosiphon pisum: Vasa and Nanos as markers. Int. J. Dev. Biol. 50 (4), 413-421 (2006).
- Koshy, A. A., Cabral, C. M. 3-D imaging and analysis of neurons infected in vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237 (2014).
- Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. Bioessays. 28 (7), 747-755 (2006).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Harland, R. M. In-situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Method. Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Wolff, C., Sommer, R., Schroder, R., Glaser, G., Tautz, D. Conserved and divergent expression aspects of the Drosophila segmentation gene hunchback in the short germ band embryo of the flour beetle Tribolium. Development. 121 (12), 4227-4236 (1995).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23 (4), 345-358 (2001).
- Lin, G. W., Cook, C. E., Miura, T., Chang, C. Posterior localization of ApVas1 positions the preformed germ plasm in the sexual oviparous pea aphid Acyrthosiphon pisum. Evodevo. 5, 18 (2014).
- Straus, W. Inhibition of peroxidase by methanol and by methanol-nitroferricyanide for use in immunoperoxidase procedures. J. Histochem. Cytochem. 19 (11), 682-688 (1971).
