Identification des conditions critiques pour Immunocoloration dans le puceron du pois embryons: L'augmentation de la perméabilité des tissus et la diminution de la coloration de fond

Les pucerons sont des insectes hémiptères avec des petits (1-10 mm) corps mous. Ils se nourrissent de plantes en suçant la sève de phloème pièces buccales perçants. En outre, ils comptent sur ​​une bactérie endosymbiotique obligatoire, Buchnera aphidicola, pour synthétiser des acides aminés essentiels qui sont déficients dans le régime alimentaire de la sève du phloème. Les pucerons ont une histoire de vie complexe qui comprend la reproduction vivipare parthénogénétique au printemps et en photopériode longue journée d'été et la reproduction ovipare sexuelle déclenchée par une photopériode de jours courts pendant laquelle ils pondent un nombre limité de ^1,2 œufs d'hiver. Au printemps ces œufs éclosent pour produire la première génération de toutes les femelles fondatrices (pucerons), à la suite de nombreux cycles de reproduction parthénogénétique jusqu'à l'automne. La parthénogenèse cyclique chez les pucerons, où les phases sexuée et asexuée alternent dans le cycle de vie annuel, a été considéré comme une nouveauté ^1,2 évolutif. Dans les pucerons vivipares parthé, L'embryogenèse a lieu dans des chambres d'œufs des tubules ovariens (de ovarioles). En revanche, les embryons ovipares sexuels se développent dans les œufs fécondés. En dehors de la plasticité de la reproduction, les pucerons peuvent afficher polyphénisme aile transgénérationnel: en réponse aux signaux de la surpopulation et des menaces de prédateurs, les femelles asexuées sans ailes peuvent vivipares produire une descendance ailée pour la migration à longue distance. Publication de la séquence du génome du puceron du pois Acyrthosiphon pisum -la première séquence du génome d'une base insectes permet hémimétaboles poursuite de l'exploration de la plasticité de la reproduction, polyphénisme de l'aile, et d'autres fonctionnalités, y compris les interactions insectes-plantes, vectorisation virale et la symbiose de pucerons sur une moléculaire base ^3.

En plus de la séquence du génome, les outils permettant de caractériser la fonction des gènes et l'expression sont nécessaires pour promouvoir le puceron du pois comme un organisme modèle mûre ^4. Nous avons décrit les protocoles robustes de l'ensemble de montage <em> hybridation in situ pour détecter l'expression de l'ARNm dans les embryons de pucerons ^5-7. L'interférence ARN (ARNi) par injection d'ARN double brin et de l'alimentation a été utilisée pour le silençage génique dans nymphes de pucerons et les adultes, mais des conditions stables pour knockdown gène dans les embryons ont pas encore été signalé ^8-10. Immunocoloration, une approche basée sur les anticorps qui peuvent détecter l'expression de la protéine dans des échantillons avant et après knockdown ARNi, a été réalisée sur les embryons du puceron du pois ^11-13. Cependant, l'augmentation de la perméabilité des tissus et l'élimination de la coloration de fond sont encore insatisfaisants utilisant des protocoles standards pour immunocoloration dans les embryons asexués vivipares du puceron du pois. Par exemple, nous avons trouvé que la pénétration des anticorps dans les tissus a diminué chez les embryons gastrulating (étapes 8 à 10) et que les embryons avec bourgeons des membres morphologiquement identifiables (étapes 13-14) ont été à peine perméable à l'anticorps. En outre, la coloration de fond a été visualisée dans le vivíparo asexuéenous pois embryons de pucerons colorées utilisant un anticorps contre le marqueur de la lignée germinale Vasa ainsi que celle contre la protéine Engrailed / invected exprimé dans les segments embryonnaires ^12,13. En fait, la coloration de fond était encore bien visible dans les embryons colorées avec l'anticorps secondaire seul.

Afin d'augmenter la perméabilité sans endommager l'intégrité des tissus de pucerons, nous augmentée avec précaution la concentration de protéinase K et déterminé les conditions optimales pour la digestion du tissu sur les embryons de pucerons. Afin d'éviter la coloration non-spécifique dans le puceron du pois, nous avons cherché des composés qui pourraient bloquer efficacement les embryons et supprimer l'activité de peroxydase endogène (POD), une enzyme utilisée pour amplifier des signaux pendant immunocoloration. Un réactif de blocage fourni par un Digoxigénine (DIG) jeu de tampons à base plutôt le sérum de chèvre normal traditionnellement utilisé (NGS) / sérum albumine bovine (BSA), réduit de façon significative la coloration de fond. En outre, le methanol a été trouvé à INHIbit l'activité de POD endogène plus efficace que le peroxyde d'hydrogène (H _{2 O 2).} Les détails concernant ces conditions spécifiques pucerons pour un marquage sur les embryons seront décrits dans les sections suivantes.