בידוד Cannulation של שיתוק Parenchymal arterioles
Summary
This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.
Abstract
arterioles parenchymal תוך-מוחי (PAS), הכוללים arterioles parenchymal, arterioles חודרת arterioles מראש נימי, הם כלי דם גבוה התנגדות מסתעפת מן העורקים pial ו arterioles וצלילה לתוך המוח parenchyma. רשות פרט perfuse טריטוריה גלילית דיסקרטית של parenchyma ואת נוירונים הנכלל. arterioles אלה הם שחקן מרכזי בויסות זרימת דם במוח הוא בעולם (autoregulation כלי דם במוח) מקומי (hyperemia הפונקציונלי). מגבר ספק הוא חלק מיחידת העצבים וכלי הדם, מבנה התואם את זרימת דם אזורי פעילות מטבולית במוח וכן כולל נוירונים, interneurons, האסטרוציטים. זלוף באמצעות מגבר הספק קשור ישירות לפעילות של נוירונים באותו שטח ועליות בפרט בעופרת מטבוליזם עצבית אל הגדלה ב זלוף המקומי הנגרם על ידי התרחבות של הזנת הרשות. הסדרת עוזרות אישיות שונה מזו של-מוגדרת בצורה יותר טובהעורקי pial. לחץ הנגרמת vasoconstriction גדול בפה ולגוון מנגנוני vasodilatory. בנוסף, Pas אינו מקבל עצבוב חיצוני מעצבי perivascular – העצבוב הוא מהותי ועקיפות בטבע באמצעות מגע עם endfeet astrocytic. לפיכך, נתונים בדבר הסדרת התכווצות שנצבר על ידי מחקרים באמצעות עורקי pial אינה לתרגם ישירות להבנת תפקוד הרשות. יתר על כן, הוא נשאר נקבע כיצד מצבים פתולוגיים, כגון יתר לחץ דם וסוכרת, להשפיע על מבנה רשות תגובתיות. פער ידע זה הוא בחלקו תוצר של הקשיים הטכניים הנוגעים בידוד cannulation רשות. בכתב היד הזה אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד cannulation של מגברי הספק מכרסם. יתר על כן, אנו מציגים דוגמאות של ניסויים שניתן לבצע עם arterioles אלה, כולל התכווצות אגוניסט-induced תגובתיות myogenic. למרות ההתמקדות של כתב היד הזה היא על cannulation הרשות ולחץ myography, מבודד רשותים יכול לשמש גם עבור מחקרים ביוכימיים, biophysical, מולקולרי, והדמיה.
Introduction
תפוצתו המוחין מאורגנת ייחודי לתמיכה בדרישות המטבולית של תאי עצב מרכזיים, תאים שיש להם מוגבלות מאגרי אנרגיה ובשל כך הם רגישות גבוהה לשינויים בלחץ חמצן ואספקת חומרי מזון דרושים. כפי תת-אוכלוסיות נוירונים מסוימות הופכות לפעילות כאשר משימות ספציפיות מבוצעות, כלי הדם מקדם גידול מקומי מאוד ב זלוף למנוע היפוקסיה ודלדול מקומיים של חומרי הזנה 1. זוהי צורה של hyperemia הפונקציונלי המכונה צימוד neurovascular, והוא תלוי בפעילות התקינה של היחידה העצבה וכלי הדם, מורכב של נוירונים פעילים, האסטרוציטים, ועורקי מוחות 2. Arterioles תוך-מוחי parenchymal, קבוצה של כלי דם המקיף parenchymal חודר ו arterioles מראש נימי, הם בעלי חשיבות מרכזית התגובה הזאת וזה אז קריטי ללמוד אותם בנפרד כדי לחקור צימוד 3 העצבים וכלי הדם.
<p class = "jove_content"> arterioles Parenchymal קטן (20 – 70 מיקרומטר קוטר פנימי) כלי דם גבוהה התנגדות כי perfuse אוכלוסיות נוירונים ברורות בתוך המוח. מסעף החוצה מן העורקים pial על פני השטח, arterioles parenchymal לחדור לתוך המוח parenchyma בזווית של 90 ᵒ כמעט להאכיל בזרימת הדם מתחת לפני הקרקע (איור 1). arterioles אלה ממלאים תפקיד קריטי בשמירה לחץ זלוף המתאים כפי שהם כלי חלקה הדיסטלי ביותר המכילים שרירים הגנה על הנימים. בניגוד במחזור pial השטח, arterioles parenchymal חסר סניפים בטחונות anastomoses, וכתוצאה מכך הם "צווארי בקבוק" של מחזור מוחות 4. כתוצאה מכך, תפקוד לקוי של arterioles parenchymal תורם להתפתחות של מחלות כלי דם במוח כגון פגיעה קוגניטיבית וסקולרית ושבץ איסכמי קטן (המכונה גם שבץ שקט או אַגמִימִי). מחקרים indicatדואר כי תפקוד לקוי arterioles parenchymal יכול להיגרם על ידי לחץ דם חיוני 5, מתח כרוני 6, והוא אירוע מוקדם במודל עכבר גנטי מחלת כלי קטנה 7. יתר על כן, חסימה הנגרמת באופן ניסיוני של arterioles חודר היחיד בחולדות מספיקה כדי לגרום שבץ איסכמי קטן כי הם גליליים בכושר, בדומה לאלו שנצפו מבוגרי בני אדם 8.בנוסף הבחנות אנטומיים אלה, מנגנוני ויסות פונקצית התכווצות שונים בין עורקי pial ו arterioles parenchymal. Vasoconstriction myogenic גדול ב arterioles parenchymal 9, ואולי בגלל חוסר עצבוב חיצוני 10, מצבים שונים של mechanotransduction 11, והבדלי Ca התאי 2+ איתות 12,13 בתאי שריר חלק בכלי דם. הראיות עולה כי מנגנוני vasodilator תלויי האנדותל ושונה גם בין vascu אלהמגזרי Lar, עם עורקי parenchymal מפגינים הסתמכות רבה יותר על מנגנוני מעורבי Ca 2+ -activated K + ערוצים ותקשורת electrotonic בתוך הקיר וסקולרית לעומת גורמי diffusible כגון תחמוצת חנקן prostacyclins 14. לכן, הנתונים שנאספו בניסויים באמצעות עורקי pial לא בהכרח חלים על Parenchymal arterioles, השארת רווח בידע שלנו של שליטה מקומית של זלוף מוחין.
למרות חשיבותם, arterioles parenchymal הם לאין ערוך תחת-למד, בעיקר בשל האתגרים הטכניים עם בידוד גובר ללימוד vivo לשעבר. בכתב היד הזה אנו מתארים שיטה לבודד cannulate arterioles parenchymal מוחין, אשר ניתן להשתמש בהם לטיפול בלחץ myography, או לבודד רקמה immunolabeling, אלקטרופיזיולוגיה, ביולוגיה מולקולרית, ואת לאנליזה ביוכימית.
Protocol
Representative Results
Discussion
arterioles parenchymal מוחין הם arterioles התנגדות גבוהה עם כמה anastomoses וענפים כי perfuse אוכלוסיות נוירונים ברורים. כלי דם מתמחים אלו הם שחקנים מרכזיים autoregulation כלי דם במוח ו צימוד neurovascular באמצעות התרחבות astrocyte בתיווך 1. החשיבות של כלי דם מיוחדים אמור מחלת כלי דם מוחית ידועה כבר כ -50 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.
Materials
| artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation/ Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μL | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
- Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer’s disease. Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).
- Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).
- Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).
- Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20, 307-316 (2013).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circ Res. 110, 285-294 (2012).
- You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat. Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).
- Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits. J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).
- Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).
- Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. Microvascular changes in the white mater in dementia. J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).
- Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. The effects of hypertension on the cerebral circulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).
- Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling. Circ Res. 95, e73-e81 (2004).
- Dacey, R. G., Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).
- Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse. J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40, 1451-1457 (2009).
