Isolamento e Incannulazione di cerebrale parenchimale Arteriole
Summary
This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.
Abstract
arteriole parenchimali intracerebrali (AP), che comprendono arteriole parenchimali, arteriole penetranti e arteriole pre-capillari, sono i vasi sanguigni ad alta resistenza si ramificano fuori dalle arterie piale e arteriole e le immersioni nel parenchima cerebrale. Individuale PA defluire in un territorio cilindrica discreta del parenchima e neuroni contenuti all'interno. Questi sono arteriole un ruolo centrale nella regolazione del flusso ematico cerebrale sia a livello globale (autoregolazione cerebrovascolare) e locale (iperemia funzionale). PAs sono parte dell'unità neurovascolare, una struttura che corrisponde flusso sanguigno regionale per attività metabolica nel cervello e comprende anche neuroni, interneuroni e astrociti. Perfusione attraverso PA è direttamente collegato con l'attività dei neuroni in quel particolare territorio e gli aumenti di portare il metabolismo neuronale ad un aumento della perfusione locale causata dalla dilatazione del feed PA. Regolamento dei PA differisce da quello di meglio caratterizzatoarterie piali. vasocostrizione pressione indotta è maggiore in PA e meccanismi vasodilatatori variano. Inoltre, PA non ricevono innervazione estrinseca dai nervi perivascolari – innervazione è intrinseca ed indiretta in natura attraverso il contatto con endfeet astrociti. Così, i dati riguardanti il regolamento contrattile accumulati da studi che utilizzano arterie piali non direttamente traducono per comprendere la funzione PA. Inoltre, rimane indeterminata come stati patologici, quali ipertensione e diabete, influiscono struttura PA e reattività. Questo gap di conoscenza è in parte una conseguenza delle difficoltà tecniche relative all'isolamento PA e cannulazione. In questo manoscritto vi presentiamo un protocollo per l'isolamento e l'incannulamento della PA roditori. Inoltre, mostriamo esempi di esperimenti che possono essere eseguite con queste arteriole, tra costrizione agonisti indotta e reattività miogenico. Anche se il focus di questo manoscritto è in PA incannulazione e myography pressione, isolato PAs può essere utilizzato anche per studi biochimici, biofisici, molecolari, e di imaging.
Introduction
La circolazione cerebrale è organizzata unicamente per supportare le richieste metaboliche dei neuroni centrali, le cellule che hanno limitato riserve di energia e di conseguenza sono molto sensibili alle variazioni di pressione di ossigeno e di sostanze nutritive necessarie. Come particolari sottopopolazioni neuronali diventa attivo quando vengono eseguite attività specifiche, la vascolarizzazione promuove un aumento altamente localizzato in perfusione per prevenire ipossia locale, e l'esaurimento delle sostanze nutritive 1. Questa è una forma di iperemia funzionale noto come accoppiamento neurovascolare, e dipende dal corretto funzionamento dell'unità neurovascolare, composto di neuroni attivi, astrociti, e le arterie cerebrali 2. Intracerebrale arteriole parenchimali, un gruppo di vasi sanguigni che comprende parenchimale, penetranti e arteriole pre-capillari, sono di importanza fondamentale per questa risposta, ed è quindi fondamentale per studiarli singolarmente al fine di indagare l'accoppiamento neurovascolare 3.
<p class = "jove_content"> arteriole parenchimali sono piccole (20 – 70 micron di diametro interno) vasi sanguigni ad alta resistenza che profumato popolazioni neuronali distinti all'interno del cervello. Branching out dalle arterie piali sulla superficie, arteriole parenchimali penetrano nel parenchima cerebrale con un angolo di circa 90 ᵒ per alimentare la microcircolazione sottosuolo (Figura 1). Questi arteriole giocano un ruolo fondamentale nel mantenere adeguata pressione di perfusione in quanto sono i lisci vasi più distali muscolari contenenti proteggono i capillari. In contrasto con la circolazione superficie piale, arteriole parenchimali mancano rami collaterali e anastomosi, e di conseguenza sono "colli di bottiglia" della circolazione cerebrale 4. Come risultato, la disfunzione delle arteriole parenchimali contribuisce allo sviluppo di malattie cerebrovascolari, come le disabilità cognitive vascolari e piccole ictus ischemici (noto anche come ictus silenziosi o cassettoni). studi indicate che la disfunzione del parenchima arteriole può essere indotta da ipertensione essenziale 5, lo stress cronico 6, ed è un evento precoce nella malattia dei piccoli vasi modello di topo genetica 7. Occlusione Inoltre, sperimentalmente indotta singoli arteriole che penetrano nei ratti è sufficiente a causare piccoli colpi ischemici che sono di forma cilindrica, simile a quelli osservati negli esseri umani vecchi 8.In aggiunta a queste distinzioni anatomiche, meccanismi che regolano la funzione contrattile differiscono tra arterie e arteriole piale parenchimali. Vasocostrizione Miogenica è maggiore nelle arteriole parenchimali 9, probabilmente a causa della mancanza di innervazione estrinseca 10, diverse modalità di mechanotransduction 11, e le differenze in intracellulare Ca 2 + Segnalazione 12,13 nelle cellule muscolari lisce vascolari. L'evidenza suggerisce che i meccanismi vasodilatatori endotelio-dipendente differiscono anche tra questi vascusegmenti lar, con arterie parenchimali espositrici maggiore affidamento sui meccanismi che coinvolgono Ca 2+ -activated K + canali e comunicazione elettrotonica all'interno della parete vascolare rispetto ai fattori diffusibili come l'ossido nitrico e prostacicline 14. Pertanto, i dati raccolti in esperimenti usando arterie piali non necessariamente applicarsi a parenchimale arteriole, lasciando una lacuna nella nostra conoscenza di controllo locale della perfusione cerebrale.
Nonostante la loro importanza, arteriole parenchimali sono di gran lunga sotto-studiato, principalmente a causa delle sfide tecniche con isolamento e di montaggio per lo studio ex vivo. In questo manoscritto descriviamo un metodo per isolare e cannulare arteriole cerebrali parenchimali, che può essere utilizzato per myography pressione, o per isolare il tessuto per immunomarcatura, elettrofisiologia, biologia molecolare e analisi biochimiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
arteriole parenchima cerebrale sono arteriole ad alta resistenza con poche anastomosi e rami che profumato popolazioni neuronali distinti. Questi vasi sanguigni specializzati sono giocatori centrali di autoregolazione cerebrovascolare e accoppiamento neurovascolare attraverso la vasodilatazione mediata astrociti-1. L'importanza di questi vasi sanguigni specializzati nella malattia vascolare cerebrale è noto da circa 50 anni, quando il lavoro pionieristico del Dr. Miller Fisher descritto alterazioni strut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.
Materials
| artificial Cerebrospinal Fluid | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation/ Cannulation | |||
| Stereo Microscope | Olympus | SZX7 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μL | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm Sterile Syringe Filter | VWR Scientific | 28145-477 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Dark Green Nylon Thread | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| Linear Alignment Single Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Video Dimension Analyzer | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| Heating Unit | Warner Instruments | 64-0102 | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
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