Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em> Xenopus</em> Kidney

Die Xenopus embryonale Niere, die pronephros, ist ein gutes Modell der Nierenentwicklung und Krankheit zu studieren. Die Embryonen entwickeln extern, sind groß, in großen Stückzahlen hergestellt werden und werden durch Mikroinjektion oder chirurgische Eingriffe leicht manipulierbar. Darüber hinaus werden die Gene regeln Nierenentwicklung in Säugetieren und Amphibien konserviert. Mammalian Nieren Fortschritte durch drei Phasen: die pronephros, Mesonephros und metanephros ^1, während der embryonalen Amphibien haben ein pronephros und erwachsene Amphibien haben ein metanephros. Die grundlegende Filtereinheit dieser Nierenformen ist das Nephron, und beide Säugetiere und Amphibien benötigen , um die gleiche Signalkaskaden und induktive Ereignisse ³ Nephrogenese ^2, zu unterziehen. Die Xenopus pronephros einen einzigen nephron enthält proximaler zusammengesetzt, Zwischen-, distalen und Anschluss Tubuli, und eine Glomus (analog dem Säuger Glomerulus) ^{1, 4-6} (1 </strOng>). Die einzelne, große Nephron in den Xenopus pronephros macht es geeignet als einfaches Modell für die Untersuchung von Genen in Nierenentwicklung und Krankheitsprozessen beteiligt.

Zellschicksal Karten wurden für frühen Xenopus – Embryonen hergestellt und sind frei im Internet unter Xenbase ^7-11 zur Verfügung. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Mikroinjektion von Lineage Tracern , die Entwicklungs Xenopus pronephros zu zielen, wobei die gleiche Technik angepasst werden kann , andere Gewebe zu zielen, wie das Herz oder die Augen. Lineage Tracern sind Etiketten (einschließlich Vitalfarbstoffen, fluoreszierend markierte Dextrane, histochemisch nachweisbare Enzyme und mRNA kodiert, fluoreszierende Proteine), die in einem frühen Blastomere injiziert werden kann, so dass die Visualisierung der Nachkommen dieser Zelle während der Entwicklung. Dieses Protokoll nutzt MEM-RFP – mRNA, die Codierung Membran rot fluoreszierendes Protein ¹² als Linie Tracer gezielt. Die gezielte Mikroinjektions techniken für einzelne Blastomeren in 4- und 8-Zellen-Embryonen hier beschriebene zur Injektion mit Morpholinos genutzt werden, um knock down Genexpression oder mit exogenen RNA ein Gen von Interesse überexprimiert. Durch die Injektion in die Bauch, pflanzliche Blastomere, in erster Linie die pronephros des Embryos wird gezielt werden, die kontralateralen pronephros als Entwicklungskontrolle verlassen. Co-Einspritzen eines Tracers verifiziert, dass der korrekte Blastomere injiziert wurde, und zeigt, welche in der Embryogeweben ergaben sich aus dem injizierten Blastomere, Verifizieren der pronephros Targeting. Immunostaining der pronephros ermöglicht die Visualisierung, wie gut die pronephric Tubuli gezielt wurden. Überexpression und Zuschlags Effekte können dann auf die Gegenseite des Embryos erzielt werden, die als Entwicklungskontrolle dient und verwendet werden kann , die pronephric Index ¹³ zu berechnen. Die Verfügbarkeit von Zellschicksal Karten ermöglicht diese gezielte Mikroinjektionstechnik verwendet werden, an Zielgewebe other als die pronephros und Co-Injektion eines fluoreszierenden Indikators erlaubt die gezielte Mikroinjektions zu jedem Gewebe vor der Analyse überprüft werden.

Während der Embryomikroinjektions sollte Entwicklungstemperatur fest geregelt werden, da die Rate der Xenopus Entwicklung auf sie stark abhängig ist ^14. (- 16 ° C 14) 4- und 8-Zellinjektionen, da die Entwicklungszeit verlangsamt Embryonen bei kühleren Temperaturen inkubiert werden. Bei 22 ° C, die Entwicklungszeit von Stufe 1 (1 Zelle) auf Stufe 3 (4 Zellen) beträgt etwa 2 Stunden, während bei 16 ° C Entwicklungszeit zu Stufe 3 ca. 4 Stunden. Es dauert etwa 15 Minuten von einem 4-Zellen-Embryo zu einem 8-Zellen (Stufe 4) Embryo bei 22 ° C zu gehen, aber dauert etwa 30 Minuten bei 16 ° C. In ähnlicher Weise bei 22 ° C, dauert es nur 30 Minuten für eine 8-Zell-Embryo zu einem 16-Zellen-Embryo (Stufe 5) fortzuschreiten. Diese Zeit wird bei 16 ° C auf 45 Minuten erhöht. Dasrefore, ist es nützlich, um die Entwicklungsrate der Embryonen zu verlangsamen, an der 8-Zellen-Stadium für Injektionszwecke ausreichend Zeit zu ermöglichen, bevor die Embryonen auf die Bühne 16-Zelle fortzuschreiten. Außerdem können Wachstumstemperaturen moduliert werden embryonale Entwicklung zu beschleunigen oder zu verlangsamen, bis die Niere vollständig entwickelt hat.

Die Epidermis der Kaulquappe stufigen Xenopus – Embryonen ist relativ transparent, erlaubt eine einfache Abbildung der Entwicklung pronephros ohne Dissektion oder Lichtung des Gewebes ^15. Aufgrund der relativen Transparenz von Xenopus – Embryonen ist die Abbildung lebender Zellen auch denkbar , ^16,17. Whole-mount die pronephros zu visualisieren immunostaining ist möglich , mit etablierten Antikörper, die die proximalen, mittleren distalen und Verbindungs ​​Tubuli der Stufe 38 beschriften – 40 Embryonen , die für die Beurteilung der pronephric Entwicklung ermöglichen nach Manipulation der Genexpression gezielt in Xenopus – Embryonen ^18-20.